כדי להתחיל, שטפו את זחלי הדרוזופילה בשלב L3 שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד ב-PBS קר. בעזרת שני זוגות מלקחיים חדים, מחזיקים את החלק הקדמי של הזחלים ומסירים כ-2/3 מרקמות הגוף. החזיקו את 1/3 הזחלים הראשונים עם זוג מלקחיים אחד וווי פה עם הזוג השני.
לאחר מכן משכו את ווי הפה בתוך הזחלים עד שהזחלים הפוכים לחלוטין. הסר את דיסקיות הרגליים והמוח כדי לקבל פגר זחל הפוך ונקי עם זוג דיסקיות כנף המחוברות לקנה הנשימה. מעבירים את דיסקיות הכנף לצינור צנטריפוגה של מיליליטר.
תקן את דיסקיות הכנף ב 4% paraformaldehyde מדולל PBS במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה. לאחר הקיבוע, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם 70% אתנול. הסירו את הראשים, הבטן, הרגליים והכנפיים מהזבובים המורדמים והניחו את בית החזה המנותח ב-PBS קר.
מקדמים את בית החזה ב-4% פאראפורמלדהיד מדולל ב-1% טריטון למשך 20 דקות תחת תסיסה. לאחר מכן שטפו את הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת באמצעות PBT תחת תסיסה. מקמו את בית החזה על סרט דו-צדדי על מגלשת זכוכית, וחתכו אותם באמצעות להב מיקרוטום חד כדי לייצר שני המיתורצות.
תקן את hemithoraces ב 4% paraformaldehyde במשך 45 דקות תחת תסיסה. שטפו את הדגימות פעמיים במשך 20 דקות כל אחת באמצעות PBT תחת תסיסה. הניחו את ההמיתורציות ב-PBS קר והשתמשו במלקחיים כדי לבודד בזהירות את שרירי הטיסה העקיפה מההמיתורצות.
חדרו לשרירים באתנול 70% למשך יומיים עד שבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר החדירה, שטפו את ה-IFMs פעמיים במשך 20 דקות כל אחד באמצעות חיץ A.לאחר מכן הוסיפו 400 מיקרוליטר של חיץ ההכלאה ובצעו טרום הכלאה של השרירים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במיקסר תרמי. הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ הכלאה טרי שהוכן המכיל את הבדיקה ואת הנוגדן הראשוני.
דוגרים על הדגימות בחושך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות ב-300 סל"ד במערבל תרמי. לאחר הדגירה, שטפו את הדגימות שלוש פעמים באמצעות חיץ A חם במשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן יש לדגור על הדגימות בנוגדנים משניים ו-DAPI מדולל בחיץ A בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם חיץ B במשך 20 דקות כל אחת לפני העברתן לשקופית מיקרוסקופ. נגבו את שאריות החיץ B והוסיפו 30 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה לשקופית. הניחו על המגלשה כיסוי בגודל 18 על 18 מ"מ ואטמו את החלקת הכיסוי באמצעות לק.
