הכנת תאי הזנה iMEF ותכנות מחדש של התמרה לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

1 כדי להתחיל, מצפים את צלחת 6 באר2 עם שני מיליליטר של 0.2% תמיסת ג'לטין לכל באר. 3 דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 4 ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. 5 לאחר מכן, יש להוסיף iMEFs לצינור 15 מיליליטר 6 המכיל 10 מיליליטר 7 של תווך פיברובלסט אנושי שחומם מראש, 8 ולערבב על ידי היפוך עדין של הצינור.

9 צנטריפוגה את מתלה התא ב 309 G למשך שלוש דקות. 10 ולהסיר את supernatant לפני לתלות מחדש את הגלולה 11 ב 12 מיליליטר של תווך פיברובלסט אנושי. 12 מניחים שני מיליליטר של תרחיף התא 13 לתוך כל באר של צלחת שש בארות מצופות ג'לטין.

14 ולדגור במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 15 ו-5% פחמן דו-חמצני. 16 השליכו את התווך מה-PDAC הנגוע בלנטיוירוס 17 ו-PDAC שאינו נגוע, ושטפו את התאים פעמיים עם PBS. 18 לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטר של טריפסין כדי לנתק את התאים.

19 ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 20 עם 5% פחמן דו-חמצני ו-5% חמצן 21 למשך 15 דקות. 22 צנטריפוגות את מתלה התא ב 300 G למשך חמש דקות. 23 ולתלות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום PDAC.

24 שטפו את צלחת ה-iMEF במדיום PDAC. 25 לאחר מכן הוסף 50, 000 תאי PDAC נגועים בלנטיוירוס 26 לכל באר בחמש בארות של צלחת iMEF, ודגור לילה 27 כפי שהודגם קודם לכן. 28 לאחר הכנת מדיום התכנות מחדש, 29 מוסיפים 100 מיקרוליטר של גורם גדילה בסיסי של פיברובלסטים 30 עד 100 מיליליטר של מדיום תכנות מחדש.

31 למחרת, שטפו את התאים הגדלים על מזיני iMEF פעמיים 32 באמצעי תכנות מחדש שחוממו מראש. 33 לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר מדיה לכל באר, 34 ודגרו לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 35 עם 5% פחמן דו-חמצני ו-3% חמצן. 36 לאחר שעברו את בריכת IPSC חמש פעמים, 37 צפו במושבות החזקות 38 תוך שמירה על מורפולוגיה דמוית ESC.

39 PDAC, BxPc3, 40 H6c7 ופיברובלסט אנושי 41 הראו ימים שונים של תכנות מחדש 42 ליצירת מורפולוגיה בוגרת דמוית ESC. 43 קווי IPSC קלונליים הוקמו 44 מכל תכנות מחדש של PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 ותאי פיברובלסט אנושיים. 47 כל קווי IPSC שנקבעו הוכתמו כחיוביים 48 עבור TRA-160, מה שאישר את התכנות מחדש שלהם לפלוריפוטנציה.