CDNA Library Preparation from the Drug Treated-Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing

כדי להתחיל, לקצור את התרופה המטופלת PBMCs על ידי צנטריפוגה ולאסוף את התא lysate בצלחת PCR. צנטריפוגה את הצלחת כדי לאסוף את הליזט בתחתית. לאחר מכן, בצע דנטורציה mRNA באמצעות thermocycler.

לאחר מכן הוסף שישה מיקרוליטרים של תערובת תגובת שעתוק הפוך לכל באר כדי להשיג נפח כולל של 12 מיקרוליטר. אטמו את הצלחת כדי להגן מפני זיהום ולמנוע אידוי. צנטריפוגו את הצלחת לאחר ערבוביה קצרה.

מקם את הצלחת על thermocycler וליזום את תוכנית תגובת שעתוק לאחור. לאחר שעתוק הפוך, צנטריפוגו את צלחת ה-PCR, הוסיפו 15 מיקרוליטר של תערובת קדם-הגברה לכל באר ואטמו אותה. הניחו את הצלחת האטומה על התרמוסייקלר והתחילו את תגובת טרום ההגברה.

כדי לנקות את cDNA, הוסיפו חרוזי טיהור מגנטיים לכל באר ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את לוחית ה-PCR על מדף מגנטי למשך חמש דקות או עד שהחרוזים נפרדים. לאחר מכן, בזהירות להסיר את supernatant.

תוך שמירה על הצלחת על המדף המגנטי, הכניסו בעדינות 100 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי שהוכן כדי לנקות את החרוזים. לאחר דגירה של 30 שניות, השתמשו בפיפט כדי לחסל את הסופרנטנט. הניחו לחרוזים להתייבש באוויר על המדף המגנטי למשך חמש דקות או עד שהאתנול יתאדה במלואו והחרוזים כבר לא ייראו מבריקים.

לאחר הסרת הצלחת מהמדף המגנטי, השהה מחדש את החרוזים ב -20 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז. מקמו מחדש את הצלחת על המדף המגנטי עד להפרדת החרוזים. העבירו את ה-eluit לצלחת PCR טרייה שהוכנה לבקרת איכות ותיוג cDNA.

לתיוג, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של תערובת התיוג עבור כל תגובה לצלחת PCR חדשה. הוסף מיקרוליטר אחד של cDNA לכל תגובה. התחל את תגובת התיוג באופן מיידי.

לאחר מכן נטרלו את התגובה על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של חיץ תג מנוטרל לכל תגובה. להעשרת PCR יש להוסיף תשעה מיקרוליטרים של תערובת PCR העשרה לכל תגובה כדי להגיע לנפח כולל של 14 מיקרוליטר. הפעל את תוכנית ההעשרה PCR.