כדי להתחיל, השתמש בפריימרים ספציפיים 515f ו- 806r כדי להגביר את האזור ההיפר-משתנה V4 של הגן 16S rNA. בצע PCR באמצעות התנאים הנתונים. לאחר מכן, הוסף 3.5 מיקרוליטר של חיץ ריצוף ו 1.5 מיקרוליטר של תערובת אנזימים לצינור.
לאחר ערבוב וסיבוב הדגימה, הגדר תגובת thermocycler. כעת, הוסף את תערובת קשירת המתאם לצינור ודגר ב 20 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ב thermocycler. הוסף 1.5 מיקרוליטר של אנזים מגיב הארכה ספציפי של אורציל לתערובת הקשירה, ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
כעת, הוסיפו 43.5 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לדנ"א של קשירת המתאם וערבבו 20 פעמים. לאחר חמש דקות, הניחו את הצינור במדף מגנטי למשך חמש עד 10 דקות להפרדת חרוזים והשליכו את הסופרנטנט. לשטוף את הגלולה עם 100 מיקרוליטר של 80% אתנול ולייבש את החרוזים במשך 30 שניות.
כדי להכתים את החרוזים בכדור, מוסיפים 8.5 מיקרוליטר של 10 מילימולר Tris HCl לתוך הצינור ולדגור במשך שתי דקות. הניחו את הצינור במדף מגנטי והוציאו 7.5 מיקרוליטר של דנ"א חמקמק כסופרנאטנט לתוך צינור חדש. הוסף ריאגנטים PCR לצינור המכיל DNA קשור מתאם כדי להגדיר תגובה של 25 מיקרוליטר.
כדי לנקות DNA מוגבר, הוסיפו 22.5 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לצינור וערבבו 20 פעמים. לאחר חמש דקות, להסיר 50 מיקרוליטר של supernatant ולשטוף את החרוזים עם 100 מיקרוליטר של 80% אתנול. מרחפים את החרוזים החומים הכהים ב-16 מיקרוליטר מים ומערבבים 20 פעמים.
הניחו את הצינור במדף המגנטי למשך 30 עד 60 שניות והעבירו 15 מיקרוליטר לצינור חדש. ערבבו 90 מיקרוליטר חיץ, מיקרוליטר אחד של צבע ושני מיקרוליטרים של דגימת ספריית דנ"א וקראו את ריכוז הדנ"א על פלואורימטר. לאחר דילול הדנ"א לשני ננו-טוחנים, יש להעמיס 27 עד 30 מיקרוליטר של תא הזרימה ולמקם אותו ברצף.
שמור את קבצי FASTQ שהתקבלו מהרצף. לחץ כדי לפתוח קובץ גיליון אלקטרוני וליצור קובץ מיפוי או מטא-נתונים. פתח את אתר Nephele, העלה את קבצי FASTQ וקרא את QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.
לאחר מכן, באמצעות DADA2, בצע קריאות מזווגות, החלפת מסנן, שגיאות כימרה ומיזוג. השתמש במסווג Naive Bayes שהוכשר על יחידת הטקסונומיה התפעולית 99% של סילבה גרסה 132, או מסד הנתונים של OTU, כדי לבצע הקצאה טקסונומית חיידקית בדמיון של 97%. פתחו את אתר MicrobiomeDB.
לחץ כדי להעלות את הקבצים, וליצור OTU אלפא מגוון, בטא מגוון, שפע יחסי, ועקומות rarefaction. לבסוף, פתח גיליון אלקטרוני והעבר נתונים כדי ליצור מפות חום, דיאגרמות חיתוך קבוצות (Venn) וגודל אפקט ניתוח הבחנה ליניארי. מפת חום המבוססת על השפע היחסי של חיידקים בשלבים שונים של ייצור היין הראתה את הדומיננטיות של פילה כגון Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota ו- Fusobacteriota.
ברמת הסוג זוהו סוגים חשובים כמו Enterobacteriaceae ו-Lactobacillaceae. ניתוח דיאגרמת Venn גילה 15 OTUs ייחודיים משותפים מהענב חייב ליין הסופי. תוצאות ריצוף האמפליקון המבוסס על אזור המשתנה V4 הצביעו גם על מגוון אלפא בשני טרמינט R ו- L.Beta ניתוח מגוון הראה שינוי בחיידקים במהלך התסיסה, אך הרכב החיידקים ביין הסופי היה דומה לזה בשלבי החובה והשמרים שנוספו.
