כדי להתחיל, תרבית Escherichia coli ב 5 מיליליטר של לוריא-Bertani, או LB, בינוני, פוליסטירן סטרילי או צינור תרבית זכוכית. יש לדגור על הצינור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד. תת-תרבות התרבות שגדלה בלילה 1 עד 50 ב-100 מיליליטר ליברה בצלוחית חרוטית.
דוגרים על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס וב-200 סל"ד למשך כשעה וחצי. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של זן הפאגים T4 הגבוה לתרבית E.coli ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול במשך שלוש שעות. ברגע שליזט הפאג T4 ברור, אספו אותם בצינור חרוטי של 50 מיליליטר.
צנטריפוגה את lysates ב 4, 000 גרם במשך 20 דקות כדי pellet כל חיידקים שנותרו פסולת התאים. מסננים לעקר את הסופרנאטנט שנוצר באמצעות מסנן ניילון 0.22 מיקרון, ולאסוף את הסינון לצינור חדש של 50 מיליליטר. הוסף נפח 0.1 של כלורופורם לפאג ליזט T4 המסונן כדי להרוג את החיידקים הנותרים ולמנוע צמיחת חיידקים.
מערבבים לזמן קצר, ודוגרים על הליזט בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות. צנטריפוגה את הליזט ב 4, 000 גרם במשך חמש דקות כדי להפריד את הכלורופורם מן הליזט. בעזרת פיפטה סרולוגית, מעבירים בזהירות את שכבת הליזט העליונה לצינור חדש של 50 מיליליטר.
הוסף 13 מיליליטר של פאג ליזט למאגר העליון של 100 קילודלטון התקן מסנן צנטריפוגלי. רכז את הליזט ב 4, 000 גרם במשך חמש דקות, או עד שרוב הליזט עבר דרך המסנן. בעזרת פיפטה P200 או P1000, טפטו בעדינות את 2 המיליליטר הנותרים של ליזט למעלה ולמטה, בתוך המאגר העליון, כדי לפתוח את קרום המסנן.
יש להשליך את התסנין מהמאגר התחתון למיכל פסולת. יש לחזור על ריכוז, ולשמור כ-2 מיליליטר של פאגים מרוכזים במאגר העליון. לאחר הסחרור האחרון, מחזירים בעדינות את הליזט שנותר למעלה ולמטה, במאגר העליון.
כדי לשטוף את הפאג lysate, להוסיף 12 מיליליטר של מגנזיום מלוחים, או SM, חיץ למאגר העליון, צנטריפוגה ב 4, 000 גרם במשך 10 דקות. לאחר השטיפה השנייה, השהה מחדש את 2 המיליליטר הנותרים של ליזט במאגר SM לנפח סופי של 10 מיליליטר. מעבירים את הליזט לצינור של 50 מיליליטר ומאחסנים אותו ב-4 מעלות צלזיוס.
כדי להסיר אנדוטוקסינים מזהמים, הוסף 0.4 כרכים של 1-אוקטאנול לנפח הכולל של ליזט. אטמו את מכסה הצינור בסרט איטום ונערו במהירות 120 סל"ד למשך שעה, ולאחר מכן דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי ללא טלטול. צנטריפוגה להפרדת הליזט המנוקה על ידי אנדוטוקסין מה-1-אוקטאנול.
הוציאו בזהירות כמה שיותר 1-אוקטאנול, באמצעות פיפטה P1000, והשליכו אותה למיכל הפסולת המתאים. באמצעות מחט 18 מד ומזרק 10 מיליליטר, לאסוף את הפאג lysate מתחת לשכבת 1-אוקטאנול הנותרת. מעבירים אליציטוטים של 1 מיליליטר של פאג ליזט T4 לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות של 1.5 מיליליטר.
מהירות ואקום את הצינורות עם מכסים פתוחים ב 4, 000 גרם כדי לאדות שאריות 1-אוקטאנול מן הליזט. הכינו דילול סדרתי של פאג ליזט בפקטורים של 10, ואז זיהו 5 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר LB, ודגרו על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, ספרו את הלוחות כדי לחשב יחידות יוצרות פלאק, או PFU.
לדלל את הליזט שנוצר ואת חיץ SM לריכוז הרצוי, ו retiter כדי לאשר. יש לאחסן את הליזט המרוכז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
