הכנת נבגי אספרגילוס פלבוס אפלטוקסיגניים וחיסון זרעי בוטנים למחקרים מאתגרים

לאחר גידול אספרגילוס פלבוס Aflatoxigenic NRRL 3357 על תפוח אדמה דקסטרוז auger שיפוע במשך שישה ימים ב 30 מעלות צלזיוס, לחלוט את נבגי הפטרייה מן המבחנה עם 10 מיליליטר של מים המכילים Tween 20. מערבלים את המבחנה למשך 20 שניות. מסננים את תרחיף הנבג הפטרייתי דרך צמר זכוכית המונח במשפך, ומשתמשים בתסנין המערבולות לדילול.

לדלל aliquot 100 מיקרוליטר של ההשעיה מסונן עם 9.9 מיליליטר מים. לאחר מערבולת, לספור את הנבגים עם hemocytometer. באמצעות הנוסחה שעל המסך, חשב את נפח המים הדרוש כדי לדלל נפח אחד של המתלה המקורי מהשיפוע ל-1000 נבגים למיקרוליטר.

הוסף נפח אחד של המתלה המקורי לכמות המים המחושבת. לאחר מכן, לפצח בעדינות את תרמילי בוטנים ולהסיר את הקליפות. מניחים את הזרעים בכד סטרילי.

הוסיפו תמיסת מי חמצן 0.05% עד שהכוס מלאה ב-70%, ואפשרו לזרעים לספוג מים למשך שלוש שעות. דקקו את תמיסת מי החמצן מהזרעים והוסיפו בערך פי שלושה מכמות תערובת מי האתנול 80% כדי לכסות את הזרעים. דוגרים במשך דקה.

לאחר מכן שטפו את הזרעים פעמיים בכמויות שוות של מים מזוקקים סטריליים. הוסף את הנפח פי חמישה של תמיסת מי חמצן 3% לכוס ואפשר לה לעמוד במשך חמש דקות. לאחר פירוק תמיסת מי חמצן, שטפו את הזרעים פעמיים בכמויות שוות של מים סטריליים.

הכניסו נייר סינון בקוטר 90 מ"מ לתוך המכסה והרטיבו את הנייר במיליליטר אחד של מים סטריליים. מניחים את המכסה על המנה. מניחים את הזרעים על מגבת נייר סטרילית.

בעזרת מלקחיים, להסיר את העור של הזרע. הניחו את הזרעים נטולי הקליפה מייד בצלחת הפטרי כדי למנוע התייבשות. חותכים כשליש מהזרע המכיל את הציר העוברי.

מפצלים את הזרע לקוטילידון, ובעזרת מקדח חד, קודחים בעומק של כ-1.5 עד שני מילימטר באמצע הצד החיצוני של כל קוטילדון. מניחים ארבע עד שש חתיכות קדוחות של הזרעים על צלחת של 1.5%. באמצעות פיפטה 10 מיקרוליטר, להוסיף שני מיקרוליטר של תרחיף הנבג לתוך החלל קדוח של כל חצי חתיכת cotyledon.

לאחר כיסוי המנה במכסה, דוגרים ב 30 מעלות צלזיוס ללא אור במשך 72 שעות.