התחמקות מהתג Epitope Tag חלבונים מואצים ואימונובלוטינג למחקרי אינטראקציה חלבון-חלבון

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

52 Views

•

02:58 min

•

January 5th, 2024

DOI :

10.3791/201505-v

January 5th, 2024

•

Hiroko Shinjo¹, Gaku Nagano¹, Shogo Ishii¹, Natsumi Himeno¹, Yutaro Yamamoto¹, Junji Sagawa¹, Ryuta Baba¹, Gentaro Egusa¹, Noboru Hattori¹, Haruya Ohno¹

¹Department of Molecular and Internal Medicine, Graduate School of Biomedical & Health Sciences, Hiroshima University

Transcript

צנטריפוגה דגימת חלבון מתויג אפיטופ ב 5, 000G במשך 30 שניות ב 4 מעלות צלזיוס. המתינו דקה אחת על קרח כדי לאפשר לחרוזים להתאזן. ואז להשליך את supernatant.

הוסף מיליליטר אחד של חיץ ליזה חלבון המכיל מעכב פרוטאז לתוך הצינור ולערבב את התוכן. סובב את הצינור על מסובב במשך מחזורים של כ -30 שניות ב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. צנטריפוגה שוב ומניחים את הצינור על קרח למשך דקה אחת כדי ליישר את החרוזים לפני השלכת הסופרנטנט.

כעת, הוסיפו 10 מיקרוליטר של מאגר דגימה והרתיחו את הדגימה בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימה ב 5, 000G במשך 30 שניות ב 4 מעלות צלזיוס. מניחים עמוד בצינור חדש עם ספיגת חלבון נמוכה ומעבירים את הג'ל לעמוד בעזרת פיפטה עם קצה חתוך.

צנטריפוגה ב 9, 730G למשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את הזרימה דרך. הניחו את הג'ל בתא האלקטרופורזה והוסיפו חיץ טריס-גליצין-SDS לנפח המתאים סביב הג'ל. טען את דגימות החלבון המדוללות על ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל סולפט.

בצע אלקטרופורזה ב 100 וולט ו 400 מיליאמפר. מעבירים את הג'ל על קרום פוליווינילידן פלואוריד ומכתימים את כתם הממברנה בחלב רזה 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBS polyoxyethylene sorbitan monolaurate על שייקר במהירות שיא במשך חמש דקות.

לבסוף, לדגור על הממברנה עם הנוגדן הראשוני במשך הלילה על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס. בתאי HEK 293 שעברו טרנספקציה, כתם חיסוני אישר את הקשר בין DYKDDDDK-PRDM16 ו-HA-EHMT1 בקבוצות שהודבקו ב-DYKDDDDK-PRDM16 וב-HA-EHMT1.

Explore More Videos

Epitope Tag

Protein Purification

Immunoblotting

Protein protein Interaction