עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענק KAKENHI מספר 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI מענק מספר 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI מענק מספר 22K08672 (H.O.), מענק מחקר של האגודה היפנית לסוכרת לחוקרים צעירים (G.N.), ומענק מחקר של MSD Life Science Foundation לחוקרים צעירים (G.N).

איור 1 מציג סקירה כללית של הפרוטוקול.
1. הכנת פתרונות ומאגרים
<ol><li>מאגר ליזה חלבונית: הכן את מאגר ליזה החלבון בעקבות דוח7 שפורסם בעבר (טבלה 1).</li>
	<li>Protein lysis buffer + protease inhibitor (PI): הוסף מעכב פרוטאז (ראה טבלת חומרים) למאגר שהוכן לעיל (שלב 1.1). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.</li>
	<li>מאגר דגימה: ערבבו 900 μL של 4x מאגר דגימה Laemmli (ראו טבלת חומרים) ו-100 μL של 2-מרקפטואתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.</li>
	<li>מלח חוצץ פוספט (PBS) עם פוליאוקסאתילן (20) סורביטן מונולאורט (PBS-P): מערבבים 1.998 ליטר PBS ו-2 מ"ל פוליאוקסאתילן (20) סורביטן מונולאורט (ראו טבלת חומרים). יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מאגר Tris/Glycine/SDS אחד: יש לערבב 450 מ"ל DDW ו-50 מ"ל של 10x Tris/Glycine/SDS. יש להכין בטמפרטורת החדר ביום השימוש.</li>
</ol>2. טרנספקציה פלסמיד
<ol><li>תרבית תאי HEK-293 בצלחת מצופה קולגן בקוטר 10 ס"מ לתת-מפגש (80%-95%) באמצעות מדיום הנשר המעובד של דולבקו המכיל 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחידות/מ"ל פניצילין G ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>מכינים 1-10 מיקרוגרם של פלסמיד7 כדי להיות transfected לכל צלחת ולעשות תערובת transfection. הוסף 150 mM NaCl לנפח סופי של 250 μL למנה. מערבלים ומסובבים את התערובת.</li>
	<li>הוסף 60 μL של 1 מ"ג/מ"ל פוליאתילנימין (PEI, ראה טבלת חומרים) לכל מנה, ולאחר מכן 150 mM NaCl לנפח סופי של 250 μL של תמיסת PEI.</li>
	<li>הוסף את תמיסת PEI לתערובת הטרנספקציה כדי ליצור תמיסה מעורבת. מיד מערבולת (במהירות הגבוהה ביותר עבור 3-5 שניות, לבצע את אותו הדבר לאחר מכן) ולהסתובב למטה.</li>
	<li>יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות. במהלך תקופה זו, לשנות את המדיום של תאי HEK-293.</li>
	<li>מפזרים 500 מיקרוליטר / צלחת של תמיסה מעורבת על כל צלחת של תאי HEK-293 ולדגור לילה (13-14 שעות).</li>
	<li>בצע החלפה בינונית למחרת.</li>
</ol>3. ליזה של תאים והכנת דגימה
הערה: כדי למנוע פירוק חלבון, יש לבצע את השלבים הבאים ללא שימור או הפשרה בהקפאה של הדגימה ככל האפשר.
<ol><li>כ-48 שעות לאחר הטרנספקציה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח, הוסיפו 500 מיקרוליטר/צלחת של חיץ ליזה חלבוני + PI, ואספו את התאים על ידי מגרד תאים ופיפטה בצינור עם ספיחת חלבון נמוכה על קרח.</li>
	<li>מערבבים כל 5 דקות ודוגרים על הדגימות על קרח במשך 10 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 16,400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. אספו את הסופרנאטנט והעבירו אותו לצינור טרי של 1.5 מ"ל עם ספיחת חלבון נמוכה. הדגימות ניתן לאחסן ב -80 ° C.</li>
	<li>לקבוע את ריכוז החלבון של הדגימות באמצעות ערכת מדידת ריכוז חלבון בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>יש להפריד בין 200-1000 מיקרוגרם של אותה כמות חלבון בכל דגימה, ולאחר מכן להוסיף מאגר ליזה של חלבון + PI כדי להתאים את הנפח הכולל ל-500-1000 מיקרוליטר. הערה: השלבים הבאים מבוצעים על קרח.</li>
</ol>4. הכנת slurry
הערה: הכינו תרחיף ביחס 1:1 של חלבון G ג'ל וג'ל אפיטופ טאג ביום שלפני או ביום של משקעים חיסוניים.
<ol><li>הכנת חלבון G ג'ל<ol><li>בעזרת קצה שקצהו חתוך, מערבבים היטב ולאחר מכן מפרידים את ג'ל החלבון G (ראו טבלת חומרים) כך שמכינים 20 מיקרוליטר חרוזים לדגימה.</li>
		<li>צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 x גרם למשך 20 שניות ב-4°C והניחו את החרוזים על קרח למשך דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים להתאזן. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של חיץ חלבון ליזה + PI לג'ל G החלבון שהוכן בשלב 4.1.2 וערבב על ידי הקשה והפוך. צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 x גרם למשך 20 שניות ב-4°C, הניחו את החרוזים על קרח למשך דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים להתאזן, והשליכו את הסופרנטנט.</li>
		<li>חזור על שלב 4.1.3 שלוש פעמים.</li>
		<li>הוסיפו נפח שווה של חיץ חלבון ליזה לג'ל G החלבון כדי ליצור תמיסת ג'ל G של חלבון ביחס של 1:1. חלבון G ג'ל slurry ניתן לאחסן ב 4 °C במשך כ 1 יום.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת ג'ל אפיטופ תג זיקה<ol><li>בעזרת קצה שקצהו חתוך, יש להתסיס היטב ולאחר מכן להפריד את ג'ל הזיקה לתג אפיטופ (ראה טבלת חומרים) כך שמכינים 10-15 מיקרוליטר חרוזים לדגימה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 5,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C ולחכות 1 דקה על קרח כדי לאפשר את החרוזים להתאזן. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של חיץ ליזה חלבון + PI לג'ל הזיקה של תג אפיטופ שהוכן בשלב 4.2.2 וערבב על ידי הקשה והפוך. צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 x גרם למשך 30 שניות ב-4°C, הניחו את החרוזים על קרח למשך דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים להתאזן, והשליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה.</li>
		<li>חזור על שלב 4.2.3 פעמיים.</li>
		<li>הוסף 500 μL של 0.1 M גליצין (pH 3.5) לג'ל אפיטופ תג זיקה שהוכן בשלב 4.2.4 וערבב על ידי הקשה והיפוך. שלב זה מבוצע כדי להסיר נוגדנים תג epitope חינם. בתוך 20 דקות לאחר הוספת גליצין, צנטריפוגה ב 5,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C, מניחים את החרוזים על קרח למשך דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים להתאזן ומשליכים את supernatant.</li>
		<li>הוסף 500 μL של חיץ ליזה חלבון + PI לג'ל הזיקה של תג אפיטופ שהוכן בשלב 4.2.5 וערבב על ידי הקשה והפוך. צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 x גרם למשך 30 שניות ב-4°C, הניחו את החרוזים על קרח למשך דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים להתאזן, והשליכו את הסופר-נטנט.</li>
		<li>חזור על שלב 4.2.6 שלוש פעמים.</li>
		<li>הוסף נפח שווה של חיץ ליזה חלבוני לג'ל הזיקה של תג האפיטופ כדי להכין תרחיף ג'ל זיקה לתג אפיטופ ביחס של 1:1. ניתן לאחסן את תרחיף הג'ל אפיטופ תג זיקה ב 4 °C למשך כ 1 יום.</li>
	</ol></li>
</ol>5. ניקוי מוקדם עם ג'ל G החלבון ולכידת קומפלקסים חלבוניים עם ג'ל זיקה תג אפיטופ
<ol><li>ערבבו 1:1 חלבון G slurry (מוכן בשלב 4) עם פיפטה עם קצה חתוך והוסיפו 40 μL בכל פעם לדגימה.</li>
	<li>סובב את הדגימה במשך שעה אחת על מסובב (ראה טבלת חומרים) בכ- 30 שניות למחזור בתא קירור (4°C).</li>
	<li>צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 x גרם למשך 20 שניות ב-4°C והניחו את החרוזים על קרח למשך דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים להתאזן.</li>
	<li>אספו את הסופרנאטנט והעבירו אותו לצינור חדש של 1.5 מ"ל עם ספיחת חלבון נמוכה.</li>
	<li>הפרד את הדגימה לקלט מהדגימה בשלב 5.4 והעבר אותה לצינור חדש של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 20-30 μL של 1: 1 epitope תג ג ג slurry לדגימה.</li>
	<li>סובבו על מסובב במשך כ-30 שניות למחזור בתא קירור (4°C) למשך שעתיים.</li>
	<li>הוסף מאגר דגימה לקלט שהוכן בשלב 5.5 כדי לדלל אותו ל- 4x, וחמם ב- 98 ° C למשך 10 דקות. הקלט יכול להיות מאוחסן ב -80 °C. הערה: בגלל האפשרות של פירוק חלבון עקב הקפאה והפשרה, יש לבצע את השלבים הבאים מבלי לשמר את החלבון ככל האפשר.</li>
</ol>6. שטיפה ופליטה של החלבונים המושקעים
<ol><li>הגדר את הטמפרטורה של בלוק החום ל 98 °C.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 5,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C ולחכות 1 דקה על קרח כדי לאפשר את החרוזים להתאזן. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מאגר ליזה חלבון + PI וערבב על ידי הקשה והפוך. סובבו על מסובב במשך כ-30 שניות בכל מחזור בתא קירור (4°C) למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 5,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C, לחכות 1 דקה על קרח כדי לאפשר את החרוזים להתאזן, ולהשליך את supernatant.</li>
	<li>חזור על שלב 6.3 5-10 פעמים.</li>
	<li>הוסף 10 μL של מאגר דגימה לדגימה שהוכנה בשלב 6.4. מרתיחים ב-98°C למשך 10 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-5,000 x גרם ב-4°C למשך 30 שניות.</li>
	<li>מניחים עמוד בצינור חדש עם ספיחת חלבון נמוכה ומעבירים את הג'ל לעמוד באמצעות פיפטה עם קצה חתוך. עמוד משמש כדי למנוע זיהום של הג'ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 9,730 x גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C. אסוף את הזרימה. ניתן לאחסן את הדגימה ב -80 °C. הערה: אם יש חשש לפירוק דגימה, יש לבצע את האימונובלוטציה הבאה ללא הקפאה.</li>
</ol>7. אימונובלוטינג
הערה: הליכי אימונובלוטינג מבוססים על דוחות קודמים 7,8.
<ol><li>טען דגימות שלמות על ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE, ראה טבלת חומרים). הערה: במידת הצורך, השתמש בג'לים גדולים כך שניתן יהיה להעביר את כל הדגימה. ג'לים עם בארות 50 μL שימשו כאן.</li>
	<li>הניחו את הג'לים בתא האלקטרופורזה והוסיפו חיץ Tris/Glycine/SDS 1x (ראו טבלת חומרים) עד לנפח המתאים סביב הג'לים.</li>
	<li>אלקטרופורזה ג'ל ב 100 V ו 400 mA.</li>
	<li>מעבירים לממברנות פוליווינילידן פלואוריד (PVDF, ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>חסום את כתמי קרום PVDF עם חלב רזה 5% ב- PBS-P למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBS-P על שייקר במהירות שיא למשך 5 דקות. בצע את אותו הליך לאחר מכן בעת הכביסה.</li>
	<li>יש לדגור למשך הלילה על שייקר עם הנוגדן הראשוני (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBS-P למחרת.</li>
	<li>יש לדגור במשך שעה עם הנוגדן המשני על שייקר בטמפרטורת החדר. הערה: אם המשקל המולקולרי של חלבון המטרה קרוב לשרשרת הכבדה IgG, שיש לה משקל מולקולרי של כ-50 kDa, ניתן להשתמש בנוגדן משני ספציפי לשרשרת קלה כדי למנוע חפיפה של רצועת המטרה עם שרשרת IgG כבדה. במחקר זה נעשה שימוש בנוגדנים ספציפיים לשרשרת אור7 או Veriblot כמגיב זיהוי IP (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>זהה להקות של חלבונים עם מצעים זוהרים peroxidase. ניתן לשמור את הממברנה ב- PBS לאחר שטיפתה פעמיים עם PBS-P.</li>
	<li>רצועה במשך 10 דקות עם תמיסת הפשטה (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>לשטוף שלוש פעמים ולחסום עם 5% חלב רזה PBS-P. הפרוטוקול לאחר מכן זהה לשלב 7.6 ואילך.</li>
</ol>

ניתוח אינטראקציה של חלבונים בתאי HEK-293 באמצעות משקעים חיסוניים משותפים

<ol>
	<li>Braun, P., Gingras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+protein-protein+interactions:+from+egg-white+to+complex+networks.">History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).</li><li>Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+proteomics;+current+achievements.">Functional proteomics; current achievements.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).</li><li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+polypeptide+marker+sequence+useful+for+recombinant+protein+identification+and+purification.">A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification.</a> Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li><li>Gerace, E., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+pull-down+of+proteins+using+anti-FLAG+M2+agarose+beads.">Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads.</a> Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).</li><li>Einhauer, A., Jungbauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLAG+peptide,+a+versatile+fusion+tag+for+the+purification+of+recombinant+proteins.">The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins.</a> Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).</li><li>Egusa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+activation+of+PPAR&#945;+maintains+thermogenic+capacity+of+beige+adipocytes.">Selective activation of PPAR&#945; maintains thermogenic capacity of beige adipocytes.</a> iScience. 26 (7), 107143 (2023).</li><li>Nagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+classical+brown+adipocytes+in+the+adult+human+perirenal+depot+is+highly+correlated+with+PRDM16-EHMT1+complex+expression.">Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression.</a> PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16.">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li><li>Kajimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+brown+and+white+fat+gene+programs+through+a+PRDM16/CtBP+transcriptional+complex.">Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex.</a> Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).</li><li>Shinkai, Y., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9+methyltransferase+G9a+and+the+related+molecule+GLP.">H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP.</a> Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).</li><li>Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+effects+on+adipocytes+are+influenced+by+the+presence+of+lysine+methyltransferases,+G9a+(EHMT2)+and+GLP+(EHMT1).">TNF&#945; effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1).</a> Biology. 12 (5), 674 (2023).</li><li>Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EHMT1+controls+brown+adipose+cell+fate+and+thermogenesis+through+the+PRDM16+complex.">EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex.</a> Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).</li><li>Bian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+establishing+a+protein-protein+interaction+network+using+tandem+affinity+purification+followed+by+mass+spectrometry+in+mammalian+cells.">Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).</li><li>Cristea, I. M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes.">Affinity purification of protein complexes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization.">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li><li>Holden, P., Horton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crude+subcellular+fractionation+of+cultured+mammalian+cell+lines.">Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines.</a> BMC Research Notes. 2, 243 (2009).</li><li>Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+detergent+concentration+conditions+for+immunoprecipitation+(IP)+coupled+with+LC-MS/MS+identification+of+interacting+proteins.">Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins.</a> Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).</li><li>Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+salt+fractionation+of+nuclei+to+analyze+chromatin-associated+proteins+from+cultured+mammalian+cells.">Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells.</a> BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).</li></ol>

אנו מצהירים כי לאף אחד מהמחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר זה.

פרוטוקול זה הוא כמעט כמו פרוטוקולים 5,7,14,15 שדווחו בעבר. הנקודה החשובה של פרוטוקול זה היא שאנו אף פעם לא עוצרים את הניסוי משלב הליזה התאית לשלב המשקעים החיסוניים. פירוק חלבונים מעכב זיהוי PPI. מסלול זמן ממושך ומחזורי הקפאה-...

חלבונים ממלאים תפקיד מרכזי בכל תפקודי התא, כולל עיבוד מידע, חילוף חומרים, תחבורה, קבלת החלטות וארגון מבני. חלבונים מתווכים את תפקידיהם על ידי אינטראקציה פיזית עם מולקולות אחרות. אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) חשובות לתיווך תפקודים תאיים, כגון תיווך העברת אותות, חישת הסביבה, המרת אנרגיה לתנועה פיזית, ויסות הפעילות של אנזימי חילוף חומרים ואיתות ושמירה על ארגון תאי1. לפיכך, ניתן להשתמש ב- PPIs כדי להבהיר פונקציות לא ידועות2. ניתן לסווג שיטות לזיהוי PPIs לשלושה סוגים: in vitro, in vivo ו - in silico. Co-immunoprecipitation (co-IP), כרומטוגרפיית זיקה, טיהור זיקה טנדם, מערכי חלבונים, תצוגת פאגים, השלמת מקטעי חלבון, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית שימשו לזיהוי PPI במבחנה 3. בין שיטות אלה, co-IP נמצא בשימוש נרחב בגלל הפשטות שלה.
תג ההיתוך FLAG מורכב משמונה חומצות אמינו (AspTyrLysAspAspAspLys: DYKDDDDK), כולל אתר מחשוף אנטרוקינאז, ותוכנן במיוחד עבור כרומטוגרפיה של זיקה חיסונית4. חלבונים המתויגים ב-DYKDDDDK מזוהים ונלכדים באמצעות נוגדן אנטי-DYKDDDDK. לכן, הם נמשכים ביעילות למטה באמצעות DYKDDDDK מחייב חרוזי אגרוז5 כדי לאשר את הקישור שלהם חלבונים ספציפיים בצורה פשוטה. משקעים חיסוניים יכולים להתבצע במגוון תאים, וניתן לאשר מגוון רחב של PPIs באמצעות נוגדנים כנגד החלבון המעניין. משקעים חיסוניים ואלוציה פפטידית עם חרוזי אגרוז אנטי-DYKDDDDK דווחו בעבר5.
כאן, אנו מספקים שיטת משקעים חיסונית פשוטה שבה פלסמיד המקודד חלבון מתויג DYKDDDDK מוכנס באופן זמני לתאי HEK-293 כדי לאשר את הקשר של שני חלבונים מעניינים. נוגדני DYKDDDDK מסוימים יכולים להיקשר הן ל-N-terminus והן ל-C-terminus של חלבוני ההיתוך, אך לא לאחרים6. לכן, כדי למנוע בלבול, יש לבחור את הנוגדן שמזהה את התג המאוחה הן ל-N והן ל-C-terminus. בעת החדרת תג אפיטופ, ייתכן שניתן יהיה להימנע משינויים קונפורמטיביים בחלבון על ידי הכנסת 3 עד 12 זוגות בסיסים בין תג האפיטופ לחלבון המטרה. עם זאת, הרצף שנוסף צריך להיות זוג בסיסים בכפולות של 3 כדי למנוע הסטת מסגרת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH8.0)</td>
			<td>Nippon gene</td>
			<td>311-90075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 &#181;L</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA931-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper M</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-93170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Coat Dish 100 mm</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>4020-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (-)</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>077-00735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>C29F4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658004JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-FLAG-PRDM16</td>
			<td>This paper</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-EHMT1</td>
			<td>This paper</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-vector</td>
			<td>This paper</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride</td>
			<td>PSI</td>
			<td>24765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>168-11805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>167-11515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17061801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTATOR RT-5</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>RT-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>skim milk</td>
			<td>Morinaga</td>
			<td>0652842&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping Solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>193-16375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704156B03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriblot</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (13E5) Rabbit mAb&#160;#4970</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4970S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoprecipitation with an anti-epitope tag affinity gel to study protein-protein interactions

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) ממלאות תפקיד מרכזי בתופעות ביולוגיות, כגון ארגון תאי, העברת אותות תוך תאיים וויסות שעתוק. לכן, הבנת PPIs היא נקודת התחלה חשובה לחקירה נוספת של תפקוד חלבון המטרה. במחקר זה, אנו מציעים שיטה פשוטה לקבוע את הקישור של שני חלבוני מטרה על ידי החדרת וקטורי ביטוי יונקים לתאי HEK-293 בשיטת פוליאתילנימין, הנחת התאים במאגר ליזה חלבוני תוצרת בית, ומשיכת חלבוני המטרה על ג'ל זיקה תג אפיטופ. בנוסף, ניתן לאשר את ה-PPI בין החלבונים השונים המאוחים של תג אפיטופ על ידי שימוש בנוגדני זיקה כנגד כל תג במקום בג'ל הזיקה של תג האפיטופ. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לאימות PPIs שונים, כולל תמציות גרעיניות, מקווי תאים אחרים. לכן, זה יכול לשמש כשיטה בסיסית במגוון רחב של ניסויי PPI. חלבונים מתפרקים על ידי מהלך זמן ממושך ומחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. לכן, ליזה תאים, immunoprecipitation, ו immunoblotting צריך להתבצע בצורה חלקה ככל האפשר.

Proteins play a major role in all cellular functions, including information processing, metabolism, transport, decision-making, and structural organization. Proteins mediate their functions by interacting physically with other molecules. Protein-protein interactions (PPIs) are important for mediating cellular functions, such as mediating signal transduction, sensing the environment, converting energy into physical movement, regulating the activity of metabolic and signaling enzymes, and maintaining cellular organization1. Thus, PPIs can be used to elucidate unknown functions2. Methods for detecting PPIs can be classified into three types: in vitro, in vivo, and in silico. Co-immunoprecipitation (co-IP), affinity chromatography, tandem affinity purification, protein arrays, phage display, protein fragment complementation, X-ray crystallography, and nuclear magnetic resonance spectroscopy have been used for in vitro PPI detection3. Among these methods, co-IP is widely used because of its simplicity.
The fusion tag FLAG consists of eight amino acids (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), including an enterokinase cleavage site, and was specifically designed for immunoaffinity chromatography4. DYKDDDDK-tagged proteins are recognized and captured using an anti-DYKDDDDK antibody. Therefore, they are efficiently pulled down using DYKDDDDK binding agarose beads5 to confirm their binding to specific proteins in a simple manner. Immunoprecipitation can be performed in a variety of cells, and a wide range of PPIs can be confirmed using antibodies against the protein of interest. Immunoprecipitation and peptide elution with anti-DYKDDDDK agarose beads have been previously reported5.
Here, we provide a simple immunoprecipitation method in which a plasmid encoding a DYKDDDDK-tagged protein is transiently introduced into HEK-293 cells to confirm the association of two proteins of interest. Certain DYKDDDDK antibodies can bind to both the N-terminus and C-terminus of the fusion proteins but not others6. Therefore, to avoid confusion, the antibody that recognizes the tag fused to both N- and C-terminus should be chosen. When inserting an epitope tag, it may be possible to avoid conformational changes in the protein by inserting 3 to 12 base pairs between the epitope tag and the target protein. However, the inserted sequence should be a base pair in multiples of 3 to avoid frameshift.

מחבר זרקור: חשיפת המנגנונים המולקולריים של ויסות אדיפוציט חום ובז'

משקעים חיסוניים עם ג'ל זיקה נגד תג אפיטופ לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

The scope of our research encompasses exploring the molecular mechanisms that regulate the development and function of brown and beige fat. Trunks, friction factors and co-factors such as the PRDM 16 complex, NFIA, and PPR alpha ELK-1 complex that we have more recently found control brown and beige fat cell fate and function. In addition, immune cell adipocyte crosstalk have been identified as key players.To advance research in your field, we employ several cutting edge technologies. These include quantitative PCR and chromatin immunoprecipitation for analyzing changes in gene expression as well as call immunoprecipitation and mass spectrometry to investigate alterations in protein-protein interactions, PPIs, associated with differentiation into beige adipocytes. Despite following the standard protocol for immunoprecipitation, detecting PPIs often proves challenging.Protein degradation is the primary cause of this issue, which we must carefully avoid. This protocol is simpler and less expensive than other techniques for examining PPIs, and does not include freeze thawing in the process, thus reducing protein degradation as much as possible.

לאדיפוציטים תרמוגניים, הידועים גם בשם אדיפוציטים חומים ובז ', יש השפעות פוטנציאליות נגד השמנת יתר ונגד אי סבילות לגלוקוז. PR (PRD1-BF1-RIZ1 הומולוגי) תחום המכיל 16 (PRDM16) הוא קו-פקטור שעתוק הממלא תפקיד חשוב בקביעת זהות אדיפוציט תרמוגנית 9,10.
EHMT1 (euchromatic hist...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Unraveling the Molecular Mechanisms of Brown and Beige Adipocyte Regulation at JoVE.com

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות להבהרת תפקודם של חלבוני המטרה, וקו-אימונומשקעים (co-IP) יכולים לאשר בקלות PPIs. הדבקנו באופן זמני פלסמיד המקודד חלבון מתויג אפיטופ לתאי HEK-293 ופיתחנו שיטת משקעים חיסוניים כדי לאשר בקלות את הקישור של שני חלבוני מטרה.

Protein-protein interactions (PPIs) play a pivotal role in biological phenomena, such as cellular organization, intracellular signal transduction, and ...

היקף המחקר שלנו כולל חקירת המנגנונים המולקולריים המווסתים את ההתפתחות והתפקוד של שומן חום ובז'. גזעים, גורמי חיכוך וקו-פקטורים כגון קומפלקס PRDM 16, NFIA וקומפלקס PPR אלפא ELK-1 שמצאנו לאחרונה שולטים בגורלם ובתפקודם של תאי שומן חומים ובז'. בנוסף, דיבור צולב של אדיפוציט תאי מערכת החיסון זוהה כשחקני מפתח.כדי לקדם את המחקר בתחום שלך, אנו משתמשים במספר טכנולוגיות חדשניות. אלה כוללים PCR כמותי ומשקעים חיסוניים של כרומטין לניתוח שינויים בביטוי גנים, כמו גם קוראים למשקעים חיסוניים וספקטרומטריית מסה כדי לחקור שינויים באינטראקציות חלבון-חלבון, PPIs, הקשורים להתמיינות לאדיפוציטים בצבע בז'. למרות ביצוע הפרוטוקול הסטנדרטי עבור משקעים חיסוניים, גילוי PPIs לעתים קרובות מתגלה כמאתגר.פירוק חלבונים הוא הגורם העיקרי לבעיה זו, שעלינו להימנע ממנה בזהירות. פרוטוקול זה פשוט יותר וזול יותר מטכניקות אחרות לבדיקת PPIs, ואינו כולל הפשרה בהקפאה בתהליך, ובכך מפחית ככל האפשר את פירוק החלבון.

immunoprecipitation-with-an-anti-epitope-tag-affinity-gel-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Immunoprecipitation with an Anti-Epitope Tag Affinity Gel to Study Protein-Protein Interactions

613 Views.  Hiroshima University. היקף המחקר שלנו כולל חקירת המנגנונים המולקולריים המווסתים את ההתפתחות והתפקוד של שומן חום ובז'. גזעים, גורמי חיכוך וקו-פקטורים כגון קומפלקס PRDM 16, NFIA וקומפלקס PPR אלפא ELK-1 שמצאנו לאחרונה שולטים בגורלם ובתפקודם של תאי שומן חומים ובז'. בנוסף, דיבור צולב של אדיפוציט תאי מערכת החיס...

Video: מחבר זרקור: חשיפת המנגנונים המולקולריים של ויסות אדיפוציט חום ובז'

Protein-protein interactions (PPIs) play a pivotal role in biological phenomena, such as cellular organization, intracellular signal transduction, and transcriptional regulation. Therefore, understanding PPIs is an important starting point for further investigation of the function of the target protein. In this study, we propose a simple method to determine the binding of two target proteins by introducing mammalian expression vectors into HEK-293 cells using the polyethylenimine method, lysing the cells in homemade protein lysis buffer, and pulling down the target proteins on an epitope tag affinity gel. In addition, the PPI between the various epitope tag fused proteins can be confirmed by using affinity antibodies against each tag instead of the epitope tag affinity gel. This protocol could also be used to verify various PPIs, including nuclear extracts, from other cell lines. Therefore, it can be used as a basic method in a variety of PPI experiments. Proteins degrade by extended time course and repeated freeze-thaw cycles. Therefore, cell lysis, immunoprecipitation, and immunoblotting should be performed as seamlessly as possible.

Protein-protein interactions are important for elucidating the function of target proteins, and co-immunoprecipitation (co-IP) can easily confirm PPIs. We transiently transfected a plasmid encoding an epitope-tagged protein into HEK-293 cells and developed an immunoprecipitation method to easily confirm the binding of two target proteins.