הכנת תרחיפים של תא בודד מאורגנואידי מעיים אנושיים תלת-ממדיים ממוינים עבור תעתיק תא בודד

כדי להתחיל, להפשיר מגיב העיכול התא אנזימטי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 10, התבוננו באורגנואידים התלת-ממדיים המתמיינים של המעי האנושי כדי להבטיח את בריאות התא. החלף את המדיה מהבארות של צלחת בת 24 בארות המכילה אורגנואידים ממוינים ב- 500 מיקרוליטר של תמיסת שחזור תאים קרים.

פיפטה למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים מקרום המרתף. מעבירים את מתלה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לדגור את הצינור על קרח במשך 10 דקות, pipeting למעלה ולמטה כל חמש דקות.

צנטריפוגה את תרחיף התא ב 400 גרם במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מן הצינור מבלי להפריע את הכדור. להשהות את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של מגיב עיכול תאים אנזימטיים שחומם מראש, pipeting למעלה ולמטה 10 פעמים.

מניחים את האורגנואידים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני. כל 10 דקות, פיפטה את כל נפח 10 פעמים באמצעות פיפטה P1000 כדי לעזור לנתק את התאים. צנטריפוגו את תרחיף התא ב 400 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של אמצעי התמיינות.

העלו והורידו במהירות את התאים 50 פעמים על קרח כדי לנתק אורגנואידים לתאים בודדים. מסננים את כל הנפח דרך מסננת קצה 70 מיקרון ואוספים את הפולט בצינור טרי של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן סנן את הפולט המתקבל דרך מסננת 70 מיקרון על מסננת קצה 40 מיקרון.

הוסף חמישה מיקרוליטרים של 0.4% Trypan Blue לחמישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים, וספור תאים בודדים קיימא באמצעות Trypan Blue Exclusion. לדלל את הדגימה עם מדיה תרבית תאים כדי לקבל 1000 תאים לכל מיקרוליטר. בסך הכל 4, 402 תאים בודדים בודדו מאורגנואידי מעיים אנושיים תלת מימדיים ממוינים, המייצגים סוגי תאים צפויים, כולל אנטרוציטים סופגים ותאים מפרישים.