הכנת תרחיפים של תא בודד מאורגנואידים במעיים אנושיים ממוינים כ-96 חד-שכבות באר

כדי להתחיל, להכין מגיב עיכול תאים אנזימטי PBS / EDTA עבור עיכול אורגנואידים במעיים אנושיים. תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, לאשר את הצמיחה של אורגנואידים מעיים אנושיים תלת מימדיים מובחנים כמו monolayers. השליכו את מדיית תרבית התאים מתרבית חד-שכבתית והחליפו אותה ב-100 מיקרוליטר PBS/EDTA.

לאחר הסרת PBS/EDTA, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של מגיב עיכול תאים אנזימטי חם לכל באר. מניחים את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ופיפטה את כל הנפח חמש פעמים כל 10 דקות למשך 20 עד 30 דקות. העבירו מיקרוליטר אחד עד שניים של תרחיף תאים למגלשת זכוכית כל 10 דקות כדי להעריך דיסוציאציה על ידי התבוננות באחוז התאים הבודדים.

לאחר הדיסוציאציה, שלבו שלוש בארות משוכפלות לכל מצב בצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 700 מיקרוליטר של מדיום התמיינות תרבית תאים המכיל 10 מעכבי ROCK מיקרומולאריים, ומערבבים בעדינות על ידי פיפט. מסננים את כל הנפח דרך מסננת קצה של 70 מיקרון, ואוספים את הזרימה בצינור טרי של 1.5 מיליליטר.

סנן את הזרימה המתקבלת דרך מסננת 70 מיקרון על מסננת קצה 40 מיקרון. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של 0.4% Trypan Blue לחמישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים, וספרו תאים בודדים בני קיימא. לדלל את הדגימה עם מדיה תרבית תאים המכילה מעכב ROCK כדי לקבל 1, 000 תאים למיקרוליטר.

בסך הכל 9, 952 תאים בודדים בודדו מאורגנואידי מעיים אנושיים ממוינים שגדלו ב -96 צלחות באר.