כדי להתחיל, פיפטה אחד עד שני מיליליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לצינור חרוטי 15 מיליליטר. מערבלים את הצינור כדי לצפות את פני השטח שלו. לאחר מכן, פיפטה חמישה מיליליטר של פתרון DPBS לתוך הצינור לאחר הסרת הפתרון נגד דבקות.
מכסים את הצינורות המצופים עד לצורך. פיפטה החוצה כל מדיום בצלחת המכילה את כיפות אורגנואיד המעי האנושי. בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום DMEM/F-12 קר לכיפה ישירות כדי לנתק אותה מהצלחת.
פיפטה מיליליטר נוסף של המדיום כדי לקצור את כל האורגנואידים שנותרו. מעבירים את המתלה לצינורות החרוטיים המצופים בקוטר 15 מיליליטר. פיפטה את המתלה למעלה ולמטה כדי לפרק אורגנואידים עד שנוצר תרחיף פרגמנט אחיד בגודל אורגנואיד הרצוי.
לאחר מכן, פיפטה החוצה aliquot של ההשעיה לספירה. מניחים את יתרת המתלים על קרח. ציירו רשת XY בתחתית כל באר של צלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות.
פיפטה 50 מיקרוליטר של DPBS לתוך הבארות. מעבירים חמישה מיקרוליטרים של aliquot לתוך כל באר. ספור ידנית את המספר הכולל של אורגנואידים בקוטר 50 עד 200 מיקרומטר.
לאחר מכן השתמש במשוואה הנתונה כדי לחשב את נפח ההשעיה האורגנואידית. לאחר ספירת האורגנואידים, הסירו את הסופרנאטנט ואת השכבה העכורה מהצינור המכיל את התרחיף הגושי שנותר. לאחר מכן פיפטה שני מיליליטר של DMEM/F-12 קר ישירות על הכדור.
צנטריפוגה את המתלה ב 200 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. עבור מערכת שמקורה בבעלי חיים, הוסף 40 מיקרוליטר של כדורית אורגנואיד מטריצה אחת שמקורה בבעלי חיים. פיפטה את האורגנואידים למעלה ולמטה כדי להפיץ אותם לתוך המטריצה.
מעבירים בעדינות את תערובת האורגנואידים של המטריקס למרכז צלחת תרבית רקמה סטרילית שחוממה מראש עם 24 בארות. דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להבטיח ג'לציה של הכיפה. לאחר מכן, פיפטה 0.5 מיליליטר של מדיה לגידול אורגנואידים במעי חם לצידי הבאר מבלי להפריע לכיפה לפני הדגירה.
עבור מערכת אורגנואידים נטולת קסנו של מטריצה, הוסף 50 מיקרוליטר של מצע גידול אורגנואידים 3X לכדורית הספרואידים. ואז פיפטה 100 מיקרוליטר של המטריצה שנבחרה, ארבעה אורגנואיד ללא קסנו להשעיה. הוסף 40 מיקרוליטר של תערובת אורגנואיד הידרוג'ל למרכז צלחת תרבית רקמות 24 בארות.
דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, פיפטה 0.5 מיליליטר של מדיה גידול אורגנואיד לאורך הצדדים של הבאר. לאחר מכן יש לדגור שוב על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, פחות מתוספת של 5% פחמן דו-חמצני ו-95% לחות.
