הערכת תפקוד פגוציטי של מקרופאגים שמקורם במח עצם בילוד באמצעות בדיקת ספיגת חיידקים פלואורסצנטית

כדי להתחיל להשעות מחדש את מח העצם של העכבר הפגוז מקרופאגים ב- DMEM מלא ללא פנול אדום או אנטיביוטיקה. זרעו 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים בצפיפות של 200, 000 לרביע בצלחת מרובעת של 35 מילימטר. הסר את המלאי המחושב מראש של Escherichia coli ממינוס 80 מעלות צלזיוס.

Aliquot את הנפח הרצוי של תרחיף התא לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.7 מיליליטר כדי להכין חיסון חיידקי בריבוי של זיהום של 25, ולאחר מכן להוסיף PBS לנפח כולל של מיליליטר אחד. צנטריפוגו את תרחיף החיידקים ב 2000 גרם במשך חמש דקות והשעו מחדש את הגלולה ב 50 מיקרוליטר של PBS. הוסיפו צבע פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH לריכוז סופי של 500 מיקרו טוחנות ודגרו במשך 20 דקות בחושך להצמדת צבע.

שטפו את החיידקים ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של PBS על ידי צנטריפוגה ב 1000 גרם במשך חמש דקות. השהה מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של DMEM מלא ללא אדום פנול ולהוסיף את תרביות המקרופאגים שמקורם במח עצם. דוגרים על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך ארבע שעות.

הוסף 200 ננוגרם של צבע פלואורסצנטי אדום חדיר לתאים כדי להכתים את הליזוזומים, עם זיהום חיידקי זוהו חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים בשפע פגוציטוזים בתוך מקרופאגים שמקורם במח עצם. הפלואורסצנטיות הירוקה מתמקמת עוד יותר עם פלואורסצנטיות אדומה המעידה על ליזוזומים חומציים. הפאגוציטוזה והמראה של מקרופאגים שמקורם במח עצם בילוד עם pH ירוק רגיש ל-pH נצפו גם הם לאורך ארבע שעות ההדבקה.