כדי להתחיל, להשיג עכבר CD 45.1 חיובי SMARTA בן שישה עד שמונה שבועות ולהזריק לו 200 מיקרוגרם של פפטיד LCMV GP 61-77 ב 100 מיקרוליטר של RPMI בינוני תוך ורידי. לאחר רכישת הטחול מהעכבר, השהה אותם בסל"ד של 2% כדי להשיג צפיפות תאים של פי 10 לתאי eighT למיליליטר והנח את הצינור עם התאים על קרח. יש להוציא 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים יחד עם 150 מיקרוליטר של חיץ צביעה לכל באר של צלחת עגולה בעלת תחתית של 96 בארות.
צנטריפוגו את הצלחת בת 96 הקידוחים ב-800 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס ומרוקנים בזהירות את הסופרנטנט. מערבבים את הצלחת ומוסיפים 200 מיקרוליטר של חיץ כתמים לכל באר. לאחר הטלת התאים, יש להשהות אותם מחדש ולדגור עליהם עם קוקטייל נוגדנים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
לאחר שטיפה פעמיים, להשעות מחדש את התאים ב 200 מיקרוליטר של חיץ מכתים ולהעביר אותם לתוך ציטומטריה זרימה. בצע ניתוח ציטומטריה של זרימה כדי לבדוק את מצב ההפעלה של תאי T חיוביים ל- SMARTA CD4. לאחר מכן זרעו פעם אחת 10 את ששת תאי ה-T החיוביים של SMARTA CD4 לכל באר לתוך צלחת של 24 בארות.
סובבו את התאים בטמפרטורה של 800 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס והוציאו בזהירות את התווך הסופרנאטנטי. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום רטרווירוס ושמונה מיקרוגרם של פוליברן לכל באר. ספין מתמיר את התאים ב 800 גרם במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת מדיום רטרווירוס, לדגור את התאים עם מיליליטר אחד של מחומם מראש 10% RPMI בתוספת interleukin 2. מעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי 15 מיליליטר וצנטריפוגות אותו. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את התאים עם 2% סל"ד כדי להשיג צפיפות תאים של אחד כפול 10 עד התאים השמיני למיליליטר.
להערכת יעילות הטרנסדוקציה, aliquot 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לתוך צלחת תחתית עגולה 96-באר. דגרו אותם על קרח עם קוקטייל נוגדנים פני השטח כולל CD4, V אלפא שתיים, ונוגדן וקטור הקשור לתג. שטפו את התאים ובצעו ציטומטריית זרימה כפי שהודגם קודם לכן.
לאחר מכן הזריקו פעם אחת 10 מתוך ששת תאי ה-T החיוביים של CD 45.1 CDA CD4 לעכבר מושתל C57BL/6 תוך ורידי ולאחר מכן פעם אחת 10 לשש יחידות יוצרות הפלאק של LCMV ארמסטרונג למחרת. לאחר רכישת splenocytes מן העכבר, להכתים אותם כדי לבדוק את הסמנים הרצויים. כדי לזהות גורמי שעתוק, לדגור על התאים עם 200 מיקרוליטר של 2% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך.
לבסוף, בצע ציטומטריית זרימה כדי לזהות גורמים בשלב זיהום LCMV חריף מוקדם. ביום השלישי לאחר ההדבקה נמצאה ביפורקציה מאוזנת של תאי T מסייעים פוליקולריים ותאי T-helper 1 בקרב תאי T חיוביים ל-MIGR1 SMARTA CD4. התמיינות מכוונת של תאי T של עוזר זקיקי דומיננטי ורמות ביטוי משופרות של BCL6 נצפו בתאי T חיוביים של MIGR1 BCL6 SMARTA CD4.
