הזריקו אחד עד שלושה מיליגרם של נוגדן CD45 מצומד נגד עכבר פלואורופור מדולל ב -100 מיליליטר של מלח רגיל תוך ורידי לכל עכבר מורדם. התחל על ידי הנחת ארבעה מיליליטר של חיץ HEPES קר כקרח מוכן בתוך צינור מיוחד dissociator רקמות על קרח עבור כל עכבר. לאחר המתת העכבר, מניחים את הריאות המנותחות בצינור הדיסוציאטור הרקמתי המתאים שלהן, מקורר על קרח.
הניחו את הצינורות על מפיץ הרקמה האוטומטי והריצו את התוכנית הראשונה שנקבעה מראש לרקמת הריאה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת מלאי ליבראז ו -500 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אמינוגואנידין לכל צינור המכיל את רקמת הריאה המנותקת. דוגרים על מיקסר אגוזים במשך 30 דקות בחום של 18 מעלות.
לאחר מכן, הניחו את הצינורות בחזרה על הדיסוציאטור והפעילו את התוכנית השנייה שנקבעה מראש לרקמת הריאה. כעת יוצקים את התרחיף החד-תאי מצינור הדיסוציאטור של הרקמה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו את צינור הדיסוציאטור של הרקמה עם חמישה מיליליטר של EHAA מלא ועברו דרך המסננת לתוך צינור 50 מיליליטר.
לאחר הסרת המסננת, העלה את נפח תרחיף התא ל -50 מיליליטר עם EHAA מלא. במקום להשתמש בצינורות מיוחדים לדיסוציאטור רקמות, הניחו את הריאות המנותחות בצינורות 1.5 מיליליטר-מיקרופוגה בהתאמה מקוררים על קרח. לאחר שכל הריאות נקצרו, העבירו כל ריאה לצינור מיקרופוגה טרי ללא כל מדיה תאית.
באמצעות מספריים, לחתוך את הריאות לשברים קטנים בתוך צינור microfuge. הוסיפו מיליליטר אחד של קוקטייל העיכול liberase TM ו-DNase I לכל צינור. יש לדגור במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
לאחר מכן, שפכו את הדגימה על מסננת תאים של 100 מיקרומטר המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר. פיפטה מוציאה את הדגימה שנותרה על המסננת. מועכים את הרקמה כנגד הרשת עם קצה הגומי של הבוכנה ממזרק סטרילי של מיליליטר.
שוטפים את המסננת עם חוצץ מיון קר, ואוספים נפח סופי של שבעה מיליליטר בצינור. בין אם בשיטת הדיסוציאציה האוטומטית או הידנית, צנטריפוגה את מתלה התא המתקבל. בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר מאחור כ 100 מיקרוליטר של supernatant ואת גלולת התא.
לבסוף, הוסף כ -100 מיקרוליטר של תמיסת בלוק Fc כדי להביא את הנפח הכולל עד 200 מיקרוליטר ומערבול במרץ כדי להשעות מחדש את הכדור.
