כדי להתחיל, צלחת 3 פעמים 10 בחזקת 6MCA205 fibrosarcoma תאים ב 10 מיליליטר של מדיום גידול מלא בצלחת פטרי 100 מ"מ. להקרין תאים עם אור אולטרה סגול לדגור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות לפחות כדי לתת להם למות. יש לשטוף במבחנה תאים דנדריטיים ממוינים, או DCs, פעמיים, במשקל 1100G במשך ארבע דקות במצע גידול שלם.
ספרו את ה-DCs הריקים שמקורם במח עצם באמצעות בדיקת הרחקת הצבע הכחול של טריפאן. צנטריפוגה את התאים הסרטניים המוקרנים ב 1100G במשך חמש דקות. הגדר את התרבית המשותפת של DCs ריקים עם תאים אפופטוטיים מוקרנים ביחס של שניים לאחד בצלחת של 12 בארות למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.
למחרת, לשטוף את התאים פעמיים ב 1100G במשך חמש דקות ב 10 מיליליטר של מדיום צמיחה מלא צינורות 15 מיליליטר. להכתמת פני השטח של התא, יש להשהות מחדש את ה-DCs שמקורם במח עצם ב-20 מיקרוליטר של חיץ FACS קר ולדגור במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר שטיפת התאים עם חיץ FACS, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS המכיל חיוניות הניתנת לקיבוע צבע אינפרא אדום קרוב למשך 30 דקות.
שטפו את התאים פעם אחת עם PBS לפני שתשהו אותם מחדש במאגר FACS. זהה את התאים המעניינים בהתבסס על מאפייני FSCA ו- SSCA שלהם. לאחר מכן התווה FSCA ו- FSCH כדי לא לכלול כפילים וגושים של תאים מהניתוח.
התווה אזור מסנן פס פליטה של 780 עד 60 ננומטר ו- SSCA להסרת תאים מתים. באמצעות מסנני מעבר פס פליטה של 575 עד 26 ו- 530 עד 30 ננומטר, זהה חיוביות תאים עבור סמן CD11C ומקשר תאים פלואורסצנטי PKH67 בשתי חלקות צפיפות פרמטרים. לאחר הספירה, תרבית את תאי CD8 T עם DCs שמקורם במח עצם שלקחו תאי MCA205 אפופטוטיים ביחס של שניים עד חמישה לאחד ב 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות.
הוסף EdU למדיום התרבית המשותפת בריכוז סופי של 10 מיקרומולר ודגר במשך 16 עד 20 שעות. צנטריפוגה CD8 cross prime פעמיים ב 1100G במשך חמש דקות כתמים עבור סמני פני השטח בחיץ FACS קר במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר שטיפת התאים פעמיים במאגר FACS, השהו אותם מחדש ב-100 מיקרוליטר של PBS המכיל את צבע המים החיוני הניתן לתיקון למשך 30 דקות.
שטפו את מתלי התאים פעם אחת עם שלושה מיליליטר של 1% BSA ב-PBS בצינורות זרימה. הוסף 100 מיקרוליטר של 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות לקיבוע התא. לדגור את התאים ב 100 מיקרוליטר של permeabilization מבוסס saponin ולשטוף מגיב במשך 15 דקות.
מוסיפים 500 מיקרוליטר של קוקטייל התגובה ודגרים במשך 30 דקות בחושך. לאחר שטיפה, להשעות מחדש את התאים ב 100 מיקרוליטר של חדירות מבוססת saponin לשטוף מגיב. זהה את התאים המעניינים בהתבסס על מאפייני FSEA ו- SSEA שלהם.
לאחר מכן התווה FSEA ו- FSEH כדי להוציא מכפילי תאים וגושי תאים מהניתוח. התווה אזור מסנן פס פליטה של 525 עד 50 ננומטר ו- SSCA להסרת תאים מתים. באמצעות תרשימי צפיפות מסנן של 530 עד 30 ו-575 עד 26 ננומטר, מזהים את החיוביות של התאים עבור CD8a ו-CD3.
נתח תאים עבור שילוב Alexa Fluor 647 EdU בהיסטוגרמה של פרמטר יחיד באמצעות מסנן פליטת פסים של 660 עד 620 ננומטר. תאים דנדריטיים חיוביים CD11c בלעו ביעילות תאי סרטן אפופטוטיים MCA205 ב 37 מעלות צלזיוס, הדגמת phagocytosis תלוי טמפרטורה בשלבים מוקדמים מחזור חסינות סרטן. לאחר פגוציטוזה, תאים דנדריטיים הראו רמות מוגברות של CD86 ו- MHC-II יחד עם רמות נמוכות יותר של PDL1.
ההתפשטות השבטית של תאי T חיוביים CD8 שהופעלו בעבר על ידי תאים דנדריטיים בוגרים הייתה ניכרת עם שיעור התרבות של כ -20%. באמצעות מודלים של גידול על שבב, נצפתה התגובה הכימוטקטית של תאי T אלה כלפי תאי סרטן ששוחררו אזעקות.
