בתור התחלה, קחו תאי U2OS בתרבית עם מפגש של 60% עד 70% ופצלו אותם באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA. הכינו לוחות 60 מ"מ על ידי הוספת פתקי כיסוי עגולים של 13 מ"מ. צלחת 400, 000 תאים בלוח 60 מ"מ המכיל מספר החלקות כיסוי עגולות 13 מ"מ.
לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות מהצלחות. מוסיפים מדיום תרבית המכיל 25 אטופוסיד מיקרומולרי, ודגרים על תאים למשך 20 דקות, שעה ושלוש שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום מן הצלחות.
לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. כדי לתקן את התאים, מוסיפים מתנול קר כקרח בנפח מספיק כדי לכסות את משטח ההחלקה, ולדגור במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את פתקי הכיסוי עם PBS שלוש פעמים והעבירו אותם לתא לחות.
לאחר הקשה על PBS, יש להוסיף 30 עד 40 מיקרוליטר של חיץ חדירה ולדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, הקש על PBS מהדגימות.
הוסף 30 עד 40 מיקרוליטר של תמיסת חסימה המסופקת בערכת PLA לכל החלקת כיסוי. לדגור את הצלחת בתא לחות שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. כעת יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים בנוגדן המדלל המסופק בערכה.
לאחר הקשה על תמיסת החסימה, יש להוסיף את תמיסת הנוגדנים הראשונית לכל החלקת כיסוי ולדגור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא לחות. לדלל את מינוס פלוס בדיקות אחד עד חמישה נוגדנים מדלל. השתמשו בשילובים כמו Donkey anti-Mouse MINUS עם Donkey anti-Goat PLUS ו-Donkey anti-Mouse MINUS עם Donkey anti-Rabbit PLUS.
כעת, יש להסיר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ולשטוף פעם אחת עם TBST. לאחר הקשה על TBST העודף, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת הבדיקה PLA להחלקות הכיסוי. לאחר מכן, לדגור בתא לחות שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
יש לדלל את חיץ הקשירה 5x במים בעלי טוהר גבוה. הקש על תמיסת הבדיקה PLA ושטוף פעם אחת עם TBST. כעת, הוסיפו ליגאז לתמיסת הקשירה בדילול 1:40 מיד לפני החלתו על הדגימות.
יש לדגור בתא הלחות שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, דללו את חיץ ההגברה פי 5 במים בעלי טוהר גבוה. לאחר הסרת תמיסת הקשירה מהדגימות, שטפו את הדגימות פעם אחת עם TBST.
מוסיפים את הפולימראז לתמיסת ההגברה בדילול 1:80 מיד לפני החלתו על הדגימות. יש לדגור בתא הלחות שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 100 דקות. הקש על מאגר ההגברה, ולאחר מכן שטוף פעמיים עם מאגר SSC במשך 10 דקות כל אחת.
לאחר שטיפת הדגימות פעמיים עם PBS, יש להוסיף את תמיסת הנוגדנים הראשונית לכל כיסוי ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה. בסיום הדגירה, יש להקיש על תמיסת הנוגדנים הראשונית ולשטוף שלוש פעמים עם TBST. לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת הנוגדנים המשנית לכל החלקת כיסוי ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
לאחר מכן, שטפו חמש פעמים עם TBST, פעמיים עם מאגר SSC ופעמיים עם מאגר SSC 0.01x. לבסוף, לרכוש תמונות מבארות שונות או לכסות אזורים מחליקים כדי למנוע ממצאים עקב דגירה לא הומוגנית, ולשמור את כל הערוצים עם דפוס שם זהה.
