מתודולוגיית ספקטרופוטומטריה לכימות קומפלקס חלבון הרשתית GPCR-11-cis בליזטים ברשתית

כדי להתחיל, לחנך את גלובוס העיניים של העכבר שעבר המתת חסד ולהפוך את העיניים להומוגניות בחיץ קר כקרח. צנטריפוגה הומוגנט ב 16, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופרנאטנט המכיל חלבונים מסיסים במים ומזהמים אחרים.

לאחר מכן יש להשהות ולהמיס את חלבוני הממברנה והממברנה בחיץ למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס על פלטפורמה מסתובבת. לאחר מכן, צנטריפוגה את חלק הממברנה resolubilized במשך שעה אחת ב 16, 000 G בארבע מעלות צלזיוס. ערבבו את הסופרנאטנט עם 30 עד 50 מיקרוליטר של חרוזי נוגדנים Rho1D4, וחרוזי נוגדנים ריקים מסוג אימונוגלובולין G בשתי דגימות עצמאיות נפרדות ודגרו במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס על פלטפורמה מסתובבת.

באמצעות מעמד מגנטי, להפריד את המשיכה כלפי מטה על ידי איסוף החרוזים. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את החרוזים עם חיץ מלח גבוה ונמוך המכיל ביס-טריס פרופאן, נתרן כלורי ו-N-דודציל-בטא-D-מלטוזיד. כדי להכתים את חלבון רודופסין, לדגור על החרוזים במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר עם חיץ 65 מיקרוליטר של הרכב נתון.

לאחר מכן באמצעות קוביית קוורץ תת-מיקרו 50 מיקרוליטר מלבנית עם צמצם של שני מילימטר ואורך נתיב של 10 מילימטר, נתח את האלואט לספיגה מ-200 ננומטר עד 800 ננומטר במסגרת סריקה מהירה עם ספקטרופוטומטר. כדי לאמת ולקבוע את האיכות, חשוף את הפולט לאור בהיר למשך דקה אחת. לאחר מכן חזור על מדידת הספיגה.

הפחת את הבליעה הריקה וחשב את היחס בין ספקטרום הספיגה המנותח. לאחר מכן התווה את ספקטרום הסופגה הריק שהוחסר, וחשב את ערך האופסין החופשי. לאחר מכן, באמצעות חוק באר-למברט, לחשב את ריכוז הרודופסין, ואז לחשב את הריכוז של אופסין ללא ליגנד, ולהעריך את ההבדל בריכוז עבור אפו-אופסין, ואופסין ללא ליגנד בכמות ובאחוזים.