כדי להתחיל, לקצור את הזרעים של צמחים מוטנטיים X134, ולאפשר להם להתייבש באופן טבעי בטמפרטורת החדר עד שתכולת הלחות מגיעה כ 13 עד 15% לאחר הפעלת מכונת הפילינג, להכניס 10 גרם של גרגרי אורז לתוך מזין כדי להסיר ביעילות את קליפת גלומה. מעבירים את זרעי האורז הקלופים לטחנת האורז ומפעילים את המכונה למשך 60 שניות כדי לחסל את שכבת האלורון המניבה אורז מלוטש. לאחר מכן, מניחים את האורז המלוטש במטחנת הרקמות.
התאימו את תדירות הטחינה ל-60 הרץ והפעילו את המטחנה למשך 15 שניות במשך שני מחזורים כדי לייצר אבקת אורז. מניחים את אבקת האורז הטחון בתבנית פטרי ומכניסים לתנור שחומם מראש ל-12 שעות. לאחר מכן הוסיפו 100 מ"ג אבקת אורז לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל והקישו בעדינות על הצינור.
מוסיפים 180 ליטר מים מטוהרים לצינור ומרתיחים את הדגימה באמבט מים למשך 20 דקות. לאחר שהדגימה מתקררת, הכניסו 4 מ"ל של AMG המכיל אלפא עמילאז לבלב לתוך הצינור. לאחר מכן, מערבבים את התוכן על מתנד מערבולת, ודגרים על הצינור ב 37 C במשך 16 שעות עם תסיסה מתמשכת.
עכשיו, להוסיף 4 מ"ל של אתנול ולערבב את המדגם באמצעות מערבולת. ואז צנטריפוגה הצינור ב 1, 500 G במשך 10 דקות. לאחר פירוק הסופרנטנט, מוסיפים 2 מ"ל של 50% אתנול, ואחריו 6 מ"ל של 50% IMS לצינור ומערבבים.
לאחר צנטריפוגה של הצינור, בזהירות לשפוך את supernatant ולהפוך את הצינור כדי לנקז נוזלים עודפים. מניחים את הצינור באמבט קרח, מוסיפים לו 2 מ"ל של 2 אשלגן הידרוקסיד טוחן, ומערבבים את הדגימה במשך 20 דקות כדי להשעות מחדש את הצאן ולהמיס עמילן עמיד. הוסף 8 מ"ל של חיץ נתרן אצטט מולארי 1.2 מותאם ל- pH 3.8 לצינור וערבב באמצעות מערבל מגנטי.
לאחר מכן מיד להציג 0.1 מ"ל של AMG לתוך התערובת ומערבבים היטב. לדגור על הדגימה במשך 30 דקות ב 50 C באמבט מים עם ערבוב לסירוגין באמצעות מערבולת. לאחר הדגירה, צנטריפוגה הצינור ב 1, 500 G במשך 10 דקות.
עכשיו להעביר 0.1 מ"ל של supernatant לצינור זכוכית טרי. הוסף 3 מ"ל של מגיב גלוקוז אוקסידאז פרוקסידאז ודגר את הדגימה ב 50 C במשך 20 דקות. בזהירות פיפטה 200 ליטר של כל פתרון מדגם ריק פתרון סטנדרטי לתוך צלחת 96 באר.
מדוד את הספיגה של כל דגימה ב- 510 ננומטר כנגד התמיסה הריקה וחשב את תכולת העמילן העמיד באמצעות הנוסחה. לבסוף, להציג את המשתתפים עם 50 גרם של אורז מוכן עם 200 מ"ל של מים. לאחר הארוחה, לאסוף דגימות דם ורידי בנקודות זמן שונות כדי לבצע ניתוח גלוקוז בדם.
תכולת העמילן העמיד הייתה גבוהה משמעותית במוטציה SBEIIb עם 5.2% בהשוואה לסוג הבר. צריכת האורז המוכן הובילה לתגובת גלוקוז איטית ומופחתת לאחר 15 ו -30 דקות עם הפחתה של 9.7% ו -3.7% בהתאמה.
