Vinculin-GFP הפלסמיד היה מתנה קנת יאמאדה, המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial, Bethesda, מרילנד, אקטין mRFP הפלסמיד היה מתנה מיכאל דוידסון, פלורידה סטייט, Tallahassee, פלורידה. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס קריירה NSF # 0747334 ו - AHA-National SDG # 0835205N כדי אנדריאה קנה הנשימה.

1. סקירה כללית של מערכת מיקרוסקופ משולב המערכת מיקרוסקופ המשמש במחקרים אלה תוארה בפירוט 1. בקצרה, הפוכה אולימפוס IX-81 מיקרוסקופ עם TIRF מצורף (אולימפוס, מרכז עמק, PA) בשילוב עם CSU-22 Yokogawa ראש סריקה (Yokogawa החשמל Inc, יפן). BioScope SZ מיקרוסקופ כוח אטומי (Veeco מכשירים Inc, סנטה ברברה, קליפורניה) הוא רכוב על גבי מיקרוסקופ אופטי הפוכה, ואת המערכת כולה מוצבת בחלק העליון של הטבלה מחקר כיתה אופטי (ניופורט, אירווין, קליפורניה). האסיפה confocal מורכב מסורק דיסק-ספינינג, גלגל מסנן חיצוני המצלמה EMCCD שלה (רופר Scientific-Photometrics, טוסון, אריזונה) מחוברים נוקשה עם לוחית אלומיניום בסיס מושם על משטח סיליקון הכרחי דעיכת רטט. סורק confocal מתחבר עם המיקרוסקופ דרך מקורבות עם צווארון חתר שניתן decoupled מן המיקרוסקופ במהלך המדידות AFM, כך אין רעידות מהסורק דיסק ספינינג, ישפיע על מדידות AFM. ארגון, קריפטון לייזר (ספקטרה פיזיקה, Mountain View, CA) משמש כמקור עירור הן TIRF מצבי הדמיה confocal, והוא יכול להיות בשילוב לחילופין בשני סיבים אופטיים אשר לספק את לייזר המצורף TIRF או ראש סריקה, בהתאמה . שני המחשבים לשלוט במערכת: Slidebook תוכנה שולטת הדמיה אופטית ותוכנת Nanoscope שולט AFM. 2. תא תרבות תאים חיים להביע GFP בונה ממוקד כנגד חלבונים ספציפיים צריך להיות ממוקם בתוך צלחת תחתית זכוכית תא תרבות 24 שעות לפני הניסוי גירוי מכני. ביום הניסוי להחליף את תרבית תאים בינוניים עם אדום בינוני ללא פנול. המנה תרבית תאים הוא רכוב על הבמה AFM עם קולר מגנטי. 3. AFM עצה הכנה מיקרוסקופ הקמה קצה AFM אישית עם מיקרון 2 biotinilated חרוז זכוכית יהיה שטף חמש פעמים עם DPBS ואז מודגרות 5 דקות עם avidin (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), שטפתי שוב עם DPBS חמש פעמים, ולאחר מכן מודגרות 5 דקות עם biotinilated 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל פיברונקטין. טיפ יהיה שטף חמש פעמים יותר בסוף 2, רכוב על הסורק AFM, ולאחר מכן את החצאית סיליקון מגן יוצבו סביב לבעל. הגדר את המיקרוסקופ לצפייה וידאו כדי ליישר את קצה AFM במרכז שדה הראייה. יישר את המנוף אופטי ידי הצבת את קרן הלייזר בסוף מאוד של שלוחה, ולאחר מכן לשנות את אובייקטיבי מטרה בהגדלה גבוהה המתאים הדמיה תא בודד. באביב קבוע של קצה חייב להיות נחוש לפני תחילת הניסוי. פרמטר זה תימדד בשיטת מנגינה תרמית זמין התוכנה Nanoscope. החלף ממצלמת וידאו אל המצלמה EMCCD כדי לאפשר הדמיה בתפרחת. לאחר מכן, בחר תא ולהביא את קצה AFM במגע עם תא ספציפי. לאחר זמן המתנה 20 דקות, אשר הוא הכרחי עבור הידבקות מוקד חזקה כדי ליצור בנקודת AFM של מגע עם פני התא, ההליך גירוי מכני יתחיל. 4. גירוי מכני של תא חי TIRF הדמיה 3-4 תהיה שיטת הבחירה של הדמיה לכימות הידבקויות מוקד, ו-ספינינג דיסק confocal הדמיה 5 ישמש לדמיין את cytoskeleton אקטין בגוף התא. AFM 6 ישמשו הדמיה מצב הקשר תחת נוזל. התמונה TIRF או confocal של התא יהיה רכשה לפני תחילת ההליך גירוי מכני. גירוי מכני יהיה המושרה על ידי החללית AFM פונקציונליות כי יועברו מעלה בשלבים בדידים כל 3-5 דקות במשך תקופה של זמן (1-1.5 שעות). התא מגיב תגובה תירשם ברציפות תוכנה Nanoscope כסדרה של תמונות גובה, כל שורה בתמונה המייצג יחידת זמן של 1 שניות. בעוד רכישת נתונים AFM, המפעיל צגים בכל עת את עמדת-z של קצה AFM, כדי לקבוע את התזמון הנכון בשביל למשוך הבא. אחרי כל גירוי מכני ניתן לרכוש תמונה TIRF או confocal של התא Slidebook תוכנה, בעוד הרף רכישת נתונים AFM. התמונות אופטי יכול להיות מעובד off-line ליצור סרטים שמראים cytoskeleton אקטין מוקד מחדש הידבקויות. כמו כן, כל תמונה ניתן לעבד כמותי כדי לקבוע תא שטח, אזור חלבון מסוים, ולנתח את המורפולוגיה תא בכלל. בסוף הניסוי קצה AFM היא נסוגה מהתא ורגישות AFM הטיפ תימדד בתוכנה Nanoscope. הניסוי הוא מאוד רגיש לרעש! כל נגיעה לדבר או מיקרוסקופ במהלך לשעברperiment יש להימנע. כדי למזער את רעש המדידות AFM, confocal את הדיסק מסתובב, צריך להיות דה מצמידים של המיקרוסקופ. זמן ההמתנה כדי ליצור מוקדי הדבקה חזקה בין שטח פני התא ואת קצה AFM עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא המשמש ואת מצופה מטריצה ​​על קצה. 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תא השריר החלק בכלי הדם אותו (VSMC) transfected עם אקטין mRFP vinculin ו-GFP היה צילמו על ידי: (א) AFM על פני התא apical; (ב) TIRF על פני השטח של התאים הבזליים, ו (ג) ספינינג דיסק מיקרוסקופיה confocal בגוף התא. התמונה confocal מוצג כהשלכה מרבי של מחסנית 3-D. חפיפה טובה בין AFM ו TIRF או ספינינג דיסק תמונות confocal מוצגים (ד) ו - (ה), בהתאמה. גודל התמונה הוא 64 x 50 מיקרון. <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. VSMC transfected עם אקטין mRFP היה מגורה באופן מכני על ידי AFM ו הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה ספינינג דיסק confocal החצים מצביעים על סיבי אקטין כי:. (א) לפלמר / לעבות, (ב) depolymerize / נעלמים, או (ג) צרור יחד בשל על ארגון מחדש אקטין. קווים מקווקווים לבן מייצגים את קצה AFM מעל התא. תמונה בגודל 91 x 91 מיקרון.

<ol>
	<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells.">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).</li><li>Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy.">Atomic Force Microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.17 (2008).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.22 (2008).</li><li>Inoue, S., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-view+high-speed+confocal+scanner:+the+CSU-10.">Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10.</a> Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).</li><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope.">Atomic force microscope.</a> Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).</li><li>Stamenovi&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+mechanics+in+airway+smooth+muscle+cells.">Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells.</a> Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).</li><li>Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+remodeling+of+the+airway+smooth+muscle+cell:+a+mechanism+for+adaptation+to+mechanical+forces+in+the+lung.">Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).</li><li>Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganization+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).</li><li>Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+Adhesions:+paradigm+for+a+signaling+nexus.">Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus.</a> Circulation Research. 98, 606-616 (2006).</li><li>Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+development+during+contractile+stimulation+of+smooth+muscle+requires+recruitment+of+paxillin+and+vinculin+to+the+membrane.">Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).</li><li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction:+all+signals+point+to+cytoskeleton,+matrix+and+integrins.">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins.</a> Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).</li><li>Zamir, E., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+complexity+and+dynamics+of+cell-matrix+adhesions.">Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions.</a> J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).</li><li>Geiger, B., Bershdsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+mechanosensory+function+of+focal+contacts.">Assembly and mechanosensory function of focal contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).</li><li>Sastry, S. K., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+Adhesions:+a+nexus+for+intracellular+signaling+and+cytoskeletal+dynamics.">Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics.</a> Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).</li><li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanotransduction.">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Dev Cell. 10, 11-20 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הידבקויות cytoskeleton 7-10 ו 11-16 הם מבנים מוקד דינמי להרכיב, להתפזר להתהפך כמו תאים נודדים או להגיב בכוח מכני 17. יש להם פונקציות משמעותי בוויסות גדילת התאים, הישרדות, ועל ביטוי גנים. ידיעת התפלגות הספציפיים שלהם ואת הדינמיקה מספקת הבנה טובה יותר של האופן שבו תאים לתקשר עם מטריקס ו - בינם לבין עצמם. מערכת זו המיקרוסקופ החדש ישים רחב על פני מגוון רחב של מחקרים דינמי מולקולריים בתאים חיים כל חסיד. המיקרוסקופ משולב המאפשר מעקב כמותי של המשנה הסלולר שינויים מהירים ומספק כלי רומן חשובים להבנת תהליך שיפוץ יסודי של הסלולר בתגובה לכוח מכני.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AFM tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novascan Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface</td>
</tr>
<tr>
<td>avidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A9275</td>
<td>1mg/mL in DPBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>F4759</td>
<td>1 mg/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21600-051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>VPI-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mattek glass bottom dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P60G-1.5-30-F</td>
<td>Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy

כדי להבין את המנגנון שבאמצעותו תאים חיים במובן כוחות מכניים, וכיצד הם מגיבים להסתגל לסביבה שלהם, טכנולוגיה חדשה מסוגלת לחקור התנהגות תאים ברמה המשנה הסלולר עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה פותחה. לפיכך, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היתה משולבת עם מיקרוסקופיה סך פנימית הקרינה (TIRF) השתקפות מהיר ספינינג דיסק (FSD) מיקרוסקופיה confocal. המערכת המשולבת הוא החלים רחב על פני מגוון רחב של מחקרים דינמי מולקולריים בתאים חיים כל חסיד, המאפשר הדמיה אופטית ישיר של תגובות התא לגירוי מכני בזמן אמת. התארגנות משמעותית של סיבי אקטין ו הידבקויות מוקד הוצגה עקב גירוי מכני מקומי על פני התא apical כי Induced שינויים לתוך המבנה התאי בגוף התא. אלו טכניקות חדשניות יספק מידע חדש להבנת השינוי המבני תא חי ואת הדינמיקה בתגובה לכוח מכני. פרוטוקול מפורט נתונים לקבוע כי נציג תא חי להראות בתגובה לגירוי מכני מוצגים.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

live-cell-response-to-mechanical-stimulation-studied-integrated

Google

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Texas A&M Health Science Center. מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

Video: Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

אפיון תכונות מכניות של דופן התא הראשוני באיברים חיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...