העבודה היא במעבדה שלנו נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות.

הכנה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips צריך להיות autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים או deionized ועיקור יש להשתמש כדי להכין פתרונות עבור coverslips כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AC (40% w / v) bis-AC (1% w / v) פתרונות עיקור על ידי סינון 0.2 מיקרומטר. הכן persulfate אמוניום 10% (APS; מים 100μg/ml) זמן קצר לפני השימוש לסנן סטרילית. החלף את הפתרון APS חודשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים כימיים כגון 3-APTMS, כלורופורם, glutaradehyde, NHS, ו SurfaSil שלא ניתן autoclaved נשמרים בקבוק מוקצה ורק לצורך הכנת הידרוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הידרוג צריך להיות מנוצל בתוך כמה ימים לאחר הדגרה למשך הלילה עם החלבון ECM המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון SurfaSil 10% כלורופורם (10 מ&quot;ל בדרך כלל מספיק עבור 20 coverslips למעלה) בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל פלקון פוליפרופילן לפני שוטף של הידרוג&#39;ל. (המעבדה שלנו בדרך כלל siliconizes coverslips העליון במהלך הצעד 0.5% הדגירה glutaraldehyde). מוסיפים את coverslips אל הצינור פלקון ורוק דקות לפחות 10. למזוג את הפתרון SurfaSil ואוויר יבש coverslips על Kimwipes בממשלה בטיחות ביולוגית שבו הידרוג יהיה מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון חום מומת BSA כדלקמן: 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון של BSA שומן חומצה חופשית PBS היא מודגרות בתוך אמבט המים 68 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אז הפתרון הוא סינון סטרילי מאוחסנים 4 ° C. </li></ul> נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שכבה של Parafilm על החצי התחתון של צלחת פטרי 150 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עד 9 25 מ&quot;מ coverslips על גבי Parafilm ו לכסות אותם עם 1 מ&quot;ל 0.1 M NaOH. דגירה של 3 דקות ואז לשאוב עם קו ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במנדף כימי, במקום 0.5 מ&quot;ל 3-APTMS על כל coverslip. דגירה של 3 דקות ואז לשאוב APTMS. אם אתה ממתין זמן רב מדי, קצף יהוו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את coverslips פעם עם מים 20 מ&quot;ל deionized בצלחת אחת. הסר את coverslips מצלחת באמצעות מלקחיים מעוקל ולהעביר אותם, עם טיפול בצד שלהם פונה כלפי מעלה, אל צלחת 150 מ&quot;מ חדשה. שטפו את coverslips עם מים deionized שלוש פעמים, על כיסא הנדנדה, כל 10 דקות לשטוף. אם לא תצליח להסיר את כל APTMS, הוא יגיב עם glutaraldehyde בשלב הבא ולהשאיר משקע עכור לבן (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה glutaraldehyde (~ 10 דקות לפני השימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים מעוקל, העברת coverslips לצלחת נקייה שכבתית עם Parafilm ואת לשאוב כל נוזל הנותרים. השתמש בקו ואקום או Kimwipe למחוק את המים הנותרים לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל coverslip לחלוטין עם 0.5 מ&quot;ל של glutaraldehyde 0.5% במים deionized סטרילית דגירה למשך 30 דקות במנדף כימי. לשאוב glutaraldehyde. לשטוף לשטוף את coverslips כמו בשלב 4. יבש coverslips לחלוטין. [אתה יכול לעצור כאן ולהשאיר את coverslips למשך מספר שבועות באזור יבש]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן להכין את הידרוג, להשתמש במלקחיים מעוקל להעביר את coverslips, למעלה בצד תגובתי, לגיליון של Parafilm כי כבר מודבק על פני השטח של הקבינט בטיחות ביולוגית. ודא כי coverslips הן שטוחות על פני השטח Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון רווי NHS ב טולואן. (להמיס כמות קטנה של NHS ב טולואן מספיק לצורך הניסוי בפרט. המשך להוסיף קצת NHS טיפין עד NHS כבר לא נמס. הפתרון רווי הוא בדרך כלל מעונן וורוד.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להכין את, acrylamide bis-acrylamide, מים APS להגיע אחוז acrylamide הרצוי. מוסיפים את ריאגנטים צינורות microcentrifuge הרשום להלן כדי בהיקף כולל של 0.8ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, אחד aliquot בכל פעם, מוסיפים את שירותי הבריאות ואת TEMED את פתרון ה-AC 0.8 מ&quot;ל, מערבולת בקצרה מיד לשפוך 3-5 ג&#39;לים באמצעות 140 μl לכל coverslip במנדף בטיחות ביולוגי. במידת האפשר, את כל הצעדים מנקודה זו צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. [הערה: coverslips בגדלים שונים יכול להיות מנוצל על בסיס צורך. אם 18 מ&quot;מ coverslips משמשים, השתמש ~ 33 μl פתרון לכל coverslip AC ו coverslip 18 מ&quot;מ siliconized העליון.] <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Bis-AC (%) </td></tr><tr><td></td><td> 0.3 (נוקשה) </td><td> 0.15 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 (רך) </td></tr><tr><td></td><td> μl </td><td> μl </td><td> μl </td><td> μl </td></tr><tr><td> מים </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED</td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום coverslip siliconized 25 מ&quot;מ על גבי ג&#39;ל אחד לפני שהוא מתחיל לפלמר. הוספת coverslip העליון צריך לאפשר AC כדי מכסות לחלוטין את coverslip התחתונה. דגירה זה &quot;כריך&quot; בטמפרטורת החדר עד AC polymerizes. (בדוק את הפתרון שיורית AC בצינור microcentrifuge כדי לקבוע מתי אירעה פילמור. בדרך כלל מספר דקות ג&#39;ל נוקשה קצת יותר עבור אלה רך יספיק.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את הכריך (כפפות סטריליות על!) והחלק את coverslip העליון עד הסככות ג&#39;ל polymerized. לאחר מכן תוכל לחלץ אותו הג&#39;ל. אם אתה ממתין זמן רב מדי לפני הסרת coverslip העליון, ג&#39;ל יהיה לקרוע את coverslip מוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל coverslip העליון. מניחים את תחתית ג&#39;ל coverslips (להלן שנקרא הידרוג&#39;ל) לתוך 6-גם צלחות עם 2 מ&quot;ל PBS / היטב. PBS ניתן להוסיף לפני או אחרי coverslip ג&#39;ל אל היטב כל אחד. שטפו את הידרוג עם PBS שלוש פעמים, על כיסא נדנדה, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 11-14 עד המספר הנדרש של הידרוג הוכנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל הידרוג&#39;ל עם 2 מ&quot;ל של פתרון פיברונקטין (3 מיקרוגרם / מ&quot;ל PBS) או חלבון ECM אחרים (ראו קליין, et al. 13 לקבלת פרטים.). החלבון ECM הופך מחויב קוולנטית אל הידרוג במהלך הדגירה לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון ECM ו-NHS לחסום unreacted עם BSA 1mg/ml חומצת שומן חום מומת חופשי בסרום ללא מדיה דקות לפחות 30 ב 37 ° C בתוך תרבית תאים חממה. שוטפים את הידרוג פעם עם PBS סטרילי או תרבות בינוני התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים המדיום המתאים תרבות המכילה FBS. מספר התאים שנזרעו על הידרוג צריך להיקבע על ידי המשתמש מבוסס על מידת התפשטות תאים confluency הנדרש לניסויים. כ -10 5 תאים בדרך כלל מספיק לניתוח המערבי סופג qPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, חלבון התא או mRNA ניתן לחלץ. Coverslips מוסרים בזהירות מבארות בעזרת מלקחיים מעוקל והניח (תא בצד למטה) על גבי 100 טיפות של μl חיץ תמוגה אשר היו מפוזרות (2-3 ס&quot;מ) לאורך גיליון Parafilm על הספסל המעבדה. (אנו משתמשים תקן חיץ SDS מדגם TRIzol, בהתאמה, כדי להכין את דגימות סופג המערבי לבודד רנ&quot;א עבור qPCR). דגירה התאים עם למאגר תמוגה למשך דקה אחת בדיוק. הסר את coverslips ולהעביר את החיץ תמוגה לצינור microcentrifuge. לחילופין להפקת RNA בלבד, המשתמש יכול להעביר את כל הידרוג לצלחת 6-היטב חדשה ולהוסיף 1ml של TRIzol / היטב. דגירה במשך 3 דקות ולהסיר TRIzol פתרון לאחסון בתוך שפופרת microcentrifuge. </li></ol> פרטים נוספים על נהלים כגון immunofluorescence, מכתים BrdU, transfection, וכו &#39;עבור תאים שנזרעו על הידרוג מתואר קליין et al. 2007 13. נציג תוצאות שטיפה יסודית של coverslips הבאה תוספת של APTMS היא צעד חשוב בהפקת &quot;תגובתי&quot; coverslips. אם אחד לא מצליח להסיר את APTMS לחלוטין, יגיב עם glutaraldehyde בשלב הבא וליצור משקע עכור לבן כפי שניתן לראות באיור 1 א. 1B איור מראה coverslip נשטף כראוי יבשים. אם המשקע מפתחת, ההליך כולו יש להפעיל מחדש מההתחלה כמו coverslip כבר אינו שמיש. בעקבות היווצרות הידרוג ציפוי עם חלבונים ECM לילה, תאים יכולים להיות seeded למחרת. כמו איור 2 מראה, יש הבדל ניכר בין תא מתפשטת על הידרוג נוקשה לעומת הרכות. כפי שניתן לראות על ידי צביעה phalloidin ב fibroblasts העכבר עובריים (MEFs), התפשטות תאים במידה רבה יותר על נוקשות לעומת הידרוג רך. ואכן, רוב התאים הצמדת הידרוג רכה יישאר קומפקטי לצרף בצורה פחות יעילה. אמנם רק מורפולוגיה MEF מוצג באיור 2, ההבדל בתא הפצת עקבי לאורך מספר שורות תאים אחרות שנבדקו 11-12,14. סודות להצלחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הליך זה התחיל, חשוב מאוד לשמור על coverslips עם הצד &quot;תגובתי&quot; מעלה לזכור באיזה צד היה מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש ללבוש כפפות בכל עת במהלך ההליך כדי לספק סביבת עבודה כי הוא סטרילי ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוב הצעדים הראשונים מבוצעים בין במנדף כימי קטר ועל הספסל מעבדה. כל הצעדים הבאים כדי להסיר glutaraldehyde עודף coverslips צריכה להתבצע תחת ארון בטיחות ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשל הבדלים בתא spreaדינג (איור 2), אנו ממליצים זריעת פעמיים את מספר התאים על הידרוג רך לעומת הידרוג נוקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך פילמור AC הוא מהיר מאוד. עבור משתמשים בפעם הראשונה, אפשר להקטין את כמות APS או TEMED בפתרון להאריך את תהליך פילמור. אל תנסו להכין יותר coverslips כמה בבת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחזור התא שבו מחקרים הסינכרון G0 נדרש, אנחנו בדרך כלל בסרום-להרעיב תאים בצלחות פלסטיק תרבות, trypsinize את התאים ולזרוע אותם על הידרוג של התאמות שונות בנוכחות mitogens (FBS ו / או גורמי גדילה). הליך זה מבטיח כי אוכלוסיית המוצא של G0-מסונכרן תאים זהים כל הדגימות. עם זאת, מחקרים רבים התמרה האות, תקופת נדרש גירוי mitogen לא יכול להיות מספיק זמן כדי לאפשר התקשרות והפצת של תאים. במקרה זה, אנו בסרום-להרעיב את התאים הידרוג ולאחר מכן ישירות לגרות אותם עם mitogen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="איור 1a" /> איור 1 א. שטף כיאות coverslip. בעקבות תוספת של APTMS, coverslip נשטף במשך 1-2 דקות לפני תוספת של הפתרון glutaraldehyde. המשקע טפסים coverslip שלא נחפף על פי הצעדים המפורטים בנוהל. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="איור 1b" /> איור 1B. נשטף כראוי coverslip. בנוסף הבאים APTMS, coverslip נשטף במשך שלוש פעמים 10 דקות כל אחד, לפני התוספת של הפתרון glutaraldehyde. המשקע לא טפסים coverslip. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מורפולוגיה של תאים על הידרוג של קשיחות שונות. נוסדה MEFs היו זורעים על פיברונקטין מצופה הידרוג של קשיחות גבוה או נמוך עבור 9 שעות. לאחר תקופת הדגירה, התאים היו קבועים, permeabilized ומוכתמים FITC-phalloidin אשר נקשר אקטין-F. MEFs על ג&#39;לים קשיחות גבוהה התערוכה סיבי מתח מפוזרים היטב בהשוואה לאלו seeded על הידרוג קשיחות נמוכה. בר סולם = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. נציג PCR כמותי תוצאה של cyclin D1 עכבר רמות ה-mRNA. סרום fibroblasts העכבר עובריים היו מורעבים מצופה על גבוה (3% acrylamide) או נמוך (0.3% acrylamide) הידרוג נוקשות מגורה עם FBS 10% עבור 9 שעות. לאחר מיצוי RNA, בזמן אמת, ניתוח כמותי PCR בוצע עבור cyclin D1 רמות mRNA (מנורמל ל 18S RNA). G0 cyclin D1 מייצג mRNA מתאי שקט. Cyclin D1 רמות ה-mRNA להגדיל באופן משמעותי על הידרוג נוקשה אך לא על הידרוג רך. הנתונים הם ממוצע + / - SD של שכפול PCR תגובות.

<ol>
	<li>Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+analysis+of+heterogeneous,+atherosclerotic+human+aorta.">Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta.</a> J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).</li><li>Bernini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+stiffness,+intima-media+thickness+and+carotid+artery+fibrosis+in+patients+with+primary+aldosteronism.">Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism.</a> J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).</li><li>Boonyasirinant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stiffness+is+increased+in+hypertrophic+cardiomyopathy+with+myocardial+fibrosis:+novel+insights+in+vascular+function+from+magnetic+resonance+imaging.">Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging.</a> J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis.">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li><li>Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+mechanical+properties+of+human+atherosclerotic+tissue+by+high-frequency+intravascular+ultrasound+imaging.+An+in+vitro+study.">Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study.</a> Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).</li><li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li><li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues:+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples.">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples.</a> Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).</li><li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior.">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).</li><li>Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion,+cellular+tension,+and+cell+cycle+control.">Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control.</a> Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).</li><li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening.">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מרכיב חיוני של תהליך פילמור הידרוג הוא להימנע היווצרות בועת אוויר אשר יאפשר תאים להיקשר coverslip הזכוכית ולא הידרוג ECM מצופה עצמו. זה ניתן למנוע על ידי בקפידה pipetting הפתרון פילמור לאחר vortexing ו חזותית ולוודא כי אין בועות אוויר הפכו לכוד בתוך הג&#39;ל. אנחנו תמיד ממליצים על הכנ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glutaraldehyde, 70%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G7776</td>
<td>Store at -20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>281778</td>
<td>Store at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>SurfaSil Siliconizing Fluid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>42800</td>
<td>Store at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>NHS (N-hydroxysucinimide Ester)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A-8060</td>
<td>Store at 4&deg;C Replace monthly</td>
</tr>
<tr>
<td>Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6003-100G</td>
<td>Store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Coverslips (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-86 25 Cir 1D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (18mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-84 18 Cir 1D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels

רקמות קשיחות הוא הקובע חשוב של תפקוד הסלולרי, ושינויים רקמות נוקשות קשורות כלל בסרטן פיברוזיס, ומחלות לב וכלי דם 1-11. גישות מסורתיות תא ביולוגי ללימוד פונקציה הסלולר לערב תאים culturing על תשתית נוקשה (צלחות פלסטיק או זכוכית coverslips) אשר אינו יכול להסביר את ההשפעה של ECM אלסטי או וריאציות קשיחות ECM בין רקמות. מודל in vivo ציות התנאים רקמה במבחנה, אנו ואחרים להשתמש ECM מצופה הידרוג. במעבדה שלנו, הידרוג מבוססים על polyacrylamide אשר יכול לחקות את טווח התאמות רקמה ביולוגית לראות 12. &quot;תגובתי&quot; תלושי לכסות מופקים על ידי הדגירה עם NaOH ואחריו תוספת של 3-APTMS. Glutaraldehyde משמש צולבות הקישור 3-APTMS ואת ג&#39;ל polyacrylamide. הפתרון של acrylamide (AC), bis-acrylamide (BIS-AC) ו persulfate אמוניום משמש פילמור של הידרוג. N-hydroxysuccinimide (NHS) הוא שולב פתרון ה-AC חלבון ECM crosslink כדי הידרוג. לאחר פילמור של הידרוג, משטח ג&#39;ל מצופה חלבון ECM של בחירה כגון, קולגן פיברונקטין, vitronectin וכו &#39; קשיחות של הידרוג ניתן לקבוע על ידי rheology או במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ובניכוי ידי שינוי אחוז AC ו / או bis-AC בפתרון 12. באופן זה, נוקשות תשתית ניתן להתאים קשיות של רקמות ביולוגיות אשר ניתן לכמת באמצעות rheology או AFM. תאים אז יכול להיות seeded על אלה הידרוג ותרבותיים בהתבסס על תנאי הניסוי הנדרש. הדמיה של התאים והתאוששות שלהם לניתוח מולקולרית היא פשוטה. במאמר זה, אנו מגדירים לקרקע רך כמו אלה שיש moduli אלסטי (E) &lt;3000 פסקל לקרקע נוקשה / רקמות אלה עם E&gt; 20,000 פסקל.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels at JoVE.com

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

ההשפעה של קשיחות מתחת לקרקע על התפקוד התאי יכול להיות המודל<em&gt; במבחנה</em&gt; באמצעות הידרוג polyacrylamide של התאמות שונות.

שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

JoVE Journal

Biology

21.9K Views.  University of Pennsylvania. ההשפעה של קשיחות מתחת לקרקע על התפקוד התאי יכול להיות המודל במבחנה באמצעות הידרוג polyacrylamide של התאמות שונות.

Video: Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...