מחקר זה מומן על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות של אוניברסיטת טקסס בארלינגטון להקים קרנות MM.

1. צמחים וחיידקים הכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בהליך זה לזרוע זרעים ארבידופסיס על v 01:01:01: v: v תערובת של גידול בינוני (Redi הארץ תקע ומערבבים שתיל, סאן Gro), vermiculite בסדר, perlite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את הצמחים בתא הגידול (22 ° C, 12 שעות של אור μmol / mm 2 / sec 100 יום ו 65 ± 5% לחות) ומים לפי הצורך. הצמחים מוכנים לשימוש בתוך 4-6 שבועות, כאשר יש להם עלים צעירים הרחיב באופן מלא לקראת נעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני תחילת הניסוי להכין את התרבות החיידק. Streak Pseudomonas syringae ממלאי גליצרול על מדיום LB שונה (10 g / L tryptone, 5 g / L תמצית שמרים, 5 g / L NaCl pH 7.0, ו - אגר 1.5%) ו דגירה של 24 שעות 28 ° C. השתמש תרבות טרי להכין את inoculum ותמיד להתחיל צלחות תרבות ממניות גליצרול כמו חיידקים הופכים אלימים פחות משנה לאחר culturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חיידקים שגדלו על הצלחת להתחיל תרבות של 10 מ&quot;ל נוזל פ syringae בתוך בקבוקון 50 מ&quot;ל Erlenmeyer. דגירה התרבות לילה בשעה 28 ° C עם נמרצת רועד עד שהוא מגיע או צפיפות אופטית OD ב 600 ננומטר בין 0.8 ו 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD ב 600 ו לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1360 במשך 10 דקות. Resuspend התאים במים מזוקקים כך OD 0.2 הסופי. OD זו תואמת את 10 8 יחידות המושבה להרכיב (CFU) / mL. עם חיידקים מוכן להמשיך להכין את העלים לבצע את assay. </li></ol> 2. ליף מכתים ו דגירה עם חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת כתם עלים הראשון להכין 20 מיקרומטר propidium יודיד או פתרון לצרכן במים. 10 מ&quot;ל של תמיסת מספיק כתם 3 עלים קטנים בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את הצמחים מן החדר צמיחה עם מלקחיים לנתק 3 צעיר, מלא מורחבת עלים. לטבול את העלים שלמים פתרון לצרכן במשך 5 דקות. ואז להסיר את העלים ולשטוף אותם בקצרה עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום הבא עלה עם המשטח התחתון פונה כלפי מטה על שקופיות מיקרוסקופ. חותכים את העלים בסכין גילוח חד לארבעה חלקים למעט וריד באמצע כך העלה מניח שטוח בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לדגור את החיידקים עם העלים, להוסיף 300 μL ההשעיה חיידקי תחת חתיכות עלה בשקופית. וודא כי פני השטח התחתון של העלה נמצא בקשר עם inoculum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות בתנאים סביבתיים אותו ששימשו לגידול צמחים. באותו זמן להתבונן עלים מתחת למיקרוסקופ, להעביר את פיסות עלים לשקופית חדשה עם המשטח התחתון פונה כלפי מעלה. שים לב לא להחליק לכסות משמש כאשר גובר על השקופיות. המדגם העלה אותו ניתן הדמיה מספר פעמים במהלך הדגירה וקורס זמן ניתן להגדיר על פי מטרות המחקר. </li></ol> 3. , מיקרוסקופית מדידה ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal (Meta LSM 510, Carl Zeiss Inc) משמש כדי לבחון את העלים. שים את פני השטח התחתון של העלים כדי לזהות את הקרינה של PI (עירור 453 ננומטר, פליטת 543 ו - 620 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגימות עלים אותו לצלם תמונות של הפיוניות לאורך זמן. שמור את התמונות למדידת רוחב הפתח הפיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת רוחב הצמצם הפיוניות של הפיוניות לפחות 60 עבור כל טיפול בכל נקודת זמן באמצעות תמונה דפדפן LSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את השגיאה הממוצעת ורמת עבור רוחב הצמצם הפיוניות. משמעות סטטיסטיים של התוצאות יכול להיות מחושב באמצעות 2 זנב, סטודנט חכם לזווג של t-test. </li></ol> 4. תמונות נציג תגובת הפיוניות כדי דגירה עם חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה תמונה מיקרוסקופיים טיפוסיים (באמצעות המטרה 20x) של פני השטח עלה ארבידופסיס תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal בתצוגה בשדה בהיר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Propidium כתמים יודיד את דופן התא של תאים קיימא להגדיל את הנראות של התאים השומר בנוסף המאפשר זיהוי של תאים פגומים לאיסוף נתונים (איור 2). מגוון של פתחי הנקבוביות הפיוניות ניתן לראות micrographs אלה, מן הפיוניות סגורות לחלוטין הפיוניות לרווחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיוניות סגורות לגמרי מזוהים על ידי הצורה של התאים השומר (איור 3). רוחב הפתח נחשבת 0 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפיוניות פתוחות (איור 4) רוחב הצמצם הראו נמדדת באמצעות קו ישר נמשך על פני שטח רחב של הנקבובית הפיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלו הן תוצאות הניסוי אופייני assay זה הפיוניות. עלים Arabidopis הודגרו בחושך עם שלושה זנים שונים של Pseudomonas syringae. רק החיידק היה Pst DC3000 מסוגל לפתוח כהה הפיוניות סגורות, כפי שנמדד על ידי רוחב הצמצם של הפיוניות 60 שנבחרו באקראי לכל זן חיידקי (איור 5). </li></oאני&gt; <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מיקרוסקופ של פני השטח של עלה של ארבידופסיס. אחת שדה הראייה של השטח עלה תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (LSCM) באמצעות המטרה 20x. שים לב הצמצם הפיוניות אינו ברור כאשר לעומת להציג את פלורסנט שנעזר מכתים יודיד propidium (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מיקרוסקופ של פני השטח של עלה יודיד מוכתם propidium ארבידופסיס. אחת שדה הראייה של השטח עלה תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (LSCM) באמצעות המטרה 20x. הערה מגוון של פתיחת הנקבוביות הפיוניות. החצים צהוב הצביע לחלוטין קרוב הפיוניות וחצים ירוקים הם הצביעו על הפיוניות לרווחה. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. לגמרי הפיוניות קרוב שזוהו על ידי צורת ופתיחת בין התאים השומר. רוחב הצמצם נחשב 0 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הפיוניות פתח המציגה את רוחב הצמצם ב מיקרומטר. המדידות נלקחו באמצעות הדפדפן LSCM מבוסס על קו ישר נמשך על פני שטח רחב של הנקבובית הפיוניות. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. הצמצם הפיוניות של עלים ארבידופסיס מודגרות עם שלושה זנים של עגבניות Pseudomonas syringae pv:.. DC3118, DB29, ו DC3000 צמחים הוחזקו בחושך בזמן ניסויים. התוצאות מוצגות כממוצע (n = 50-70) ± שגיאת התקן. משמעות סטטיסטיים זוהה עם מבחן t-שני זנב של הסטודנטים. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים עם תוצאות דומות.

<ol>
	<li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y., Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> The Arabidopsis Book. , (2002).</li><li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הצגנו הליך ישר קדימה כדי למדוד את הצמצם הפיוניות ברקמה עלה שלם המאפשר הערכה קלה של הפיוניות תגובה לטיפולים שונים. למרות הצגנו תוצאות השימוש במערכת מודל ארבידופסיס / Pseudomonas syringae, assay עלה שלם הפיוניות יכול להתבצע באופן פוטנציאלי עם שילוב צמחים חיידק כלשהו. הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה כדי להתאים לדרישות צמיחה של צמחים אחרים חיידקים פתוגנים. העיקרון הליך הכולל נשאר אותו הדבר. בנוסף, שיטה זו עשויה להועיל לחוקרים המבקשים ללמוד פלט התפקודית של התאים השומר לא רק לחיות חיידקים, אלא גם לגירויים אחרים בחומרים כימיים בתנאים לשמור על הסביבה הטבעית של העלה. עלים שלמים יכול להיות קשה בשל עובי תמונה שלה טופוגרפיה אחידה. בעיה זו ניתן להקל על ידי הסרת ורידים באמצע העלה כך שהוא מניח שטוח בשקופית באמצעות מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן להשתמש כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פני השטח עלה.

<table><tbody><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-1</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Difco Laboratories</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR international</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio Express</td><td>J637-2500G</td><td></td></tr><tr><td>Plant growth chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging

הפיוניות הם פתחים טבעיים האפידרמיס המפעל אחראי חילוף הגזים בין הצמח הפנים ואיכות הסביבה. הם נוצרו על ידי זוג של תאים השומר, אשר מסוגלים לסגור את הנקבוביות הפיוניות בתגובה למספר גורמים חיצוניים כולל עוצמת האור, ריכוז דו תחמוצת הפחמן, והלחות היחסית (RH). נקבוביות הפיוניות הוא גם הנתיב העיקרי לכניסה הפתוגן לתוך העלים, צעד חיוני להתפתחות המחלה. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי סגירת נקבוביות יעיל לצמצום התפתחות מחלה חיידקית בצמחים ארבידופסיס; חלק אינטגרלי של חסינות מולדת צמח. בעבר, השתמשנו קליפות אפידרמיס כדי להעריך את התגובה הפיוניות לחיות חיידקים (Melotto et al 2006.), אולם שמירה על תנאים סביבתיים נוחים עבור שתי קליפות צמח אפידרמיס ותאי חיידקים כבר מאתגר. האפידרמיס ליף יכולים להישמר חי ובריא עם MES חיץ (10 mM KCl, 25 מ&quot;מ MES-KOH, pH 6.15) עבור ניסויים של תאים אלקטרו השומר. עם זאת, החיץ הזה אינו מתאים לקבלת ההשעיה חיידקי. מצד שני, תאים חיידקיים יכולים להישמר חי במים וזה לא תקין כדי לשמור על קליפות אפידרמיס לתקופה ארוכה של פעמים. כאשר צף על פני המים לקלף אפידרמיס, התאים לקלף, כי הם חשופים אוויר יבש בתוך 4 שעות להגביל את העיתוי לבצע את הניסוי. השיטה האידיאלית להעריך את ההשפעה של גירוי מסוים על תאים השומר צריך להציג התערבות מינימלית הפיזיולוגיה הפיוניות ועל הסביבה הטבעית של הצמח כמה שיותר. אנו, אפוא, פיתחו שיטה חדשה כדי להעריך את התגובה הפיוניות לחיות חיידקים אשר ופצע עלה מניפולציה ממוזער באופן משמעותי במטרה לספק assay הפיוניות לשחזור בקלות ואמין. פרוטוקול מבוסס על מכתים עלה שלם עם יודיד propidium (PI), הדגירה של מכתים עלה עם ההשעיה חיידקי, והתבוננות עלים תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal. לבסוף, שיטה זו מאפשרת תצפית המדגם העלה אותו לחיות על פרקי זמן ארוכים באמצעות תנאים מקרוב לחקות את התנאים הטבעיים שבהם צמחים מותקפים על ידי פתוגנים.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging at JoVE.com

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

assessing-stomatal-response-to-live-bacterial-cells-using-whole-leaf

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K Views.  University of Texas at Arlington. פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

Video: Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biology

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

מדידת תגובה סטומטית אוטומטית לפלישת חיידקים בארבידופסיס

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

מחבר זרקור: קידום מחקר סטומטלי עם מדידת צמצם אוטומטית

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.

הנוגע לתכונות מוליכות הפיוניות פונקציונליות ליף

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

הנוגע לתכונות מוליכות הפיוניות פונקציונליות ליף

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ