מחקר זה מומן על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות של אוניברסיטת טקסס בארלינגטון להקים קרנות MM.

1. צמחים וחיידקים הכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בהליך זה לזרוע זרעים ארבידופסיס על v 01:01:01: v: v תערובת של גידול בינוני (Redi הארץ תקע ומערבבים שתיל, סאן Gro), vermiculite בסדר, perlite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את הצמחים בתא הגידול (22 ° C, 12 שעות של אור μmol / mm 2 / sec 100 יום ו 65 ± 5% לחות) ומים לפי הצורך. הצמחים מוכנים לשימוש בתוך 4-6 שבועות, כאשר יש להם עלים צעירים הרחיב באופן מלא לקראת נעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני תחילת הניסוי להכין את התרבות החיידק. Streak Pseudomonas syringae ממלאי גליצרול על מדיום LB שונה (10 g / L tryptone, 5 g / L תמצית שמרים, 5 g / L NaCl pH 7.0, ו - אגר 1.5%) ו דגירה של 24 שעות 28 ° C. השתמש תרבות טרי להכין את inoculum ותמיד להתחיל צלחות תרבות ממניות גליצרול כמו חיידקים הופכים אלימים פחות משנה לאחר culturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חיידקים שגדלו על הצלחת להתחיל תרבות של 10 מ&quot;ל נוזל פ syringae בתוך בקבוקון 50 מ&quot;ל Erlenmeyer. דגירה התרבות לילה בשעה 28 ° C עם נמרצת רועד עד שהוא מגיע או צפיפות אופטית OD ב 600 ננומטר בין 0.8 ו 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD ב 600 ו לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1360 במשך 10 דקות. Resuspend התאים במים מזוקקים כך OD 0.2 הסופי. OD זו תואמת את 10 8 יחידות המושבה להרכיב (CFU) / mL. עם חיידקים מוכן להמשיך להכין את העלים לבצע את assay. </li></ol> 2. ליף מכתים ו דגירה עם חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת כתם עלים הראשון להכין 20 מיקרומטר propidium יודיד או פתרון לצרכן במים. 10 מ&quot;ל של תמיסת מספיק כתם 3 עלים קטנים בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את הצמחים מן החדר צמיחה עם מלקחיים לנתק 3 צעיר, מלא מורחבת עלים. לטבול את העלים שלמים פתרון לצרכן במשך 5 דקות. ואז להסיר את העלים ולשטוף אותם בקצרה עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום הבא עלה עם המשטח התחתון פונה כלפי מטה על שקופיות מיקרוסקופ. חותכים את העלים בסכין גילוח חד לארבעה חלקים למעט וריד באמצע כך העלה מניח שטוח בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לדגור את החיידקים עם העלים, להוסיף 300 μL ההשעיה חיידקי תחת חתיכות עלה בשקופית. וודא כי פני השטח התחתון של העלה נמצא בקשר עם inoculum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות בתנאים סביבתיים אותו ששימשו לגידול צמחים. באותו זמן להתבונן עלים מתחת למיקרוסקופ, להעביר את פיסות עלים לשקופית חדשה עם המשטח התחתון פונה כלפי מעלה. שים לב לא להחליק לכסות משמש כאשר גובר על השקופיות. המדגם העלה אותו ניתן הדמיה מספר פעמים במהלך הדגירה וקורס זמן ניתן להגדיר על פי מטרות המחקר. </li></ol> 3. , מיקרוסקופית מדידה ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal (Meta LSM 510, Carl Zeiss Inc) משמש כדי לבחון את העלים. שים את פני השטח התחתון של העלים כדי לזהות את הקרינה של PI (עירור 453 ננומטר, פליטת 543 ו - 620 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגימות עלים אותו לצלם תמונות של הפיוניות לאורך זמן. שמור את התמונות למדידת רוחב הפתח הפיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת רוחב הצמצם הפיוניות של הפיוניות לפחות 60 עבור כל טיפול בכל נקודת זמן באמצעות תמונה דפדפן LSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את השגיאה הממוצעת ורמת עבור רוחב הצמצם הפיוניות. משמעות סטטיסטיים של התוצאות יכול להיות מחושב באמצעות 2 זנב, סטודנט חכם לזווג של t-test. </li></ol> 4. תמונות נציג תגובת הפיוניות כדי דגירה עם חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה תמונה מיקרוסקופיים טיפוסיים (באמצעות המטרה 20x) של פני השטח עלה ארבידופסיס תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal בתצוגה בשדה בהיר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Propidium כתמים יודיד את דופן התא של תאים קיימא להגדיל את הנראות של התאים השומר בנוסף המאפשר זיהוי של תאים פגומים לאיסוף נתונים (איור 2). מגוון של פתחי הנקבוביות הפיוניות ניתן לראות micrographs אלה, מן הפיוניות סגורות לחלוטין הפיוניות לרווחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיוניות סגורות לגמרי מזוהים על ידי הצורה של התאים השומר (איור 3). רוחב הפתח נחשבת 0 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפיוניות פתוחות (איור 4) רוחב הצמצם הראו נמדדת באמצעות קו ישר נמשך על פני שטח רחב של הנקבובית הפיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלו הן תוצאות הניסוי אופייני assay זה הפיוניות. עלים Arabidopis הודגרו בחושך עם שלושה זנים שונים של Pseudomonas syringae. רק החיידק היה Pst DC3000 מסוגל לפתוח כהה הפיוניות סגורות, כפי שנמדד על ידי רוחב הצמצם של הפיוניות 60 שנבחרו באקראי לכל זן חיידקי (איור 5). </li></oאני&gt; <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מיקרוסקופ של פני השטח של עלה של ארבידופסיס. אחת שדה הראייה של השטח עלה תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (LSCM) באמצעות המטרה 20x. שים לב הצמצם הפיוניות אינו ברור כאשר לעומת להציג את פלורסנט שנעזר מכתים יודיד propidium (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מיקרוסקופ של פני השטח של עלה יודיד מוכתם propidium ארבידופסיס. אחת שדה הראייה של השטח עלה תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (LSCM) באמצעות המטרה 20x. הערה מגוון של פתיחת הנקבוביות הפיוניות. החצים צהוב הצביע לחלוטין קרוב הפיוניות וחצים ירוקים הם הצביעו על הפיוניות לרווחה. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. לגמרי הפיוניות קרוב שזוהו על ידי צורת ופתיחת בין התאים השומר. רוחב הצמצם נחשב 0 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הפיוניות פתח המציגה את רוחב הצמצם ב מיקרומטר. המדידות נלקחו באמצעות הדפדפן LSCM מבוסס על קו ישר נמשך על פני שטח רחב של הנקבובית הפיוניות. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. הצמצם הפיוניות של עלים ארבידופסיס מודגרות עם שלושה זנים של עגבניות Pseudomonas syringae pv:.. DC3118, DB29, ו DC3000 צמחים הוחזקו בחושך בזמן ניסויים. התוצאות מוצגות כממוצע (n = 50-70) ± שגיאת התקן. משמעות סטטיסטיים זוהה עם מבחן t-שני זנב של הסטודנטים. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים עם תוצאות דומות.

<ol>
	<li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y., Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> The Arabidopsis Book. , (2002).</li><li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הצגנו הליך ישר קדימה כדי למדוד את הצמצם הפיוניות ברקמה עלה שלם המאפשר הערכה קלה של הפיוניות תגובה לטיפולים שונים. למרות הצגנו תוצאות השימוש במערכת מודל ארבידופסיס / Pseudomonas syringae, assay עלה שלם הפיוניות יכול להתבצע באופן פוטנציאלי עם שילוב צמחים חיידק כלשהו. הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה כדי להתאים לדרישות צמיחה של צמחים אחרים חיידקים פתוגנים. העיקרון הליך הכולל נשאר אותו הדבר. בנוסף, שיטה זו עשויה להועיל לחוקרים המבקשים ללמוד פלט התפקודית של התאים השומר לא רק לחיות חיידקים, אלא גם לגירויים אחרים בחומרים כימיים בתנאים לשמור על הסביבה הטבעית של העלה. עלים שלמים יכול להיות קשה בשל עובי תמונה שלה טופוגרפיה אחידה. בעיה זו ניתן להקל על ידי הסרת ורידים באמצע העלה כך שהוא מניח שטוח בשקופית באמצעות מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן להשתמש כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פני השטח עלה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Propidium iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P4864</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP1421-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0127-01-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>7647-14-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio Express</td>
<td>J637-2500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plant growth chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shaker incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser scanning confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging

הפיוניות הם פתחים טבעיים האפידרמיס המפעל אחראי חילוף הגזים בין הצמח הפנים ואיכות הסביבה. הם נוצרו על ידי זוג של תאים השומר, אשר מסוגלים לסגור את הנקבוביות הפיוניות בתגובה למספר גורמים חיצוניים כולל עוצמת האור, ריכוז דו תחמוצת הפחמן, והלחות היחסית (RH). נקבוביות הפיוניות הוא גם הנתיב העיקרי לכניסה הפתוגן לתוך העלים, צעד חיוני להתפתחות המחלה. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי סגירת נקבוביות יעיל לצמצום התפתחות מחלה חיידקית בצמחים ארבידופסיס; חלק אינטגרלי של חסינות מולדת צמח. בעבר, השתמשנו קליפות אפידרמיס כדי להעריך את התגובה הפיוניות לחיות חיידקים (Melotto et al 2006.), אולם שמירה על תנאים סביבתיים נוחים עבור שתי קליפות צמח אפידרמיס ותאי חיידקים כבר מאתגר. האפידרמיס ליף יכולים להישמר חי ובריא עם MES חיץ (10 mM KCl, 25 מ&quot;מ MES-KOH, pH 6.15) עבור ניסויים של תאים אלקטרו השומר. עם זאת, החיץ הזה אינו מתאים לקבלת ההשעיה חיידקי. מצד שני, תאים חיידקיים יכולים להישמר חי במים וזה לא תקין כדי לשמור על קליפות אפידרמיס לתקופה ארוכה של פעמים. כאשר צף על פני המים לקלף אפידרמיס, התאים לקלף, כי הם חשופים אוויר יבש בתוך 4 שעות להגביל את העיתוי לבצע את הניסוי. השיטה האידיאלית להעריך את ההשפעה של גירוי מסוים על תאים השומר צריך להציג התערבות מינימלית הפיזיולוגיה הפיוניות ועל הסביבה הטבעית של הצמח כמה שיותר. אנו, אפוא, פיתחו שיטה חדשה כדי להעריך את התגובה הפיוניות לחיות חיידקים אשר ופצע עלה מניפולציה ממוזער באופן משמעותי במטרה לספק assay הפיוניות לשחזור בקלות ואמין. פרוטוקול מבוסס על מכתים עלה שלם עם יודיד propidium (PI), הדגירה של מכתים עלה עם ההשעיה חיידקי, והתבוננות עלים תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal. לבסוף, שיטה זו מאפשרת תצפית המדגם העלה אותו לחיות על פרקי זמן ארוכים באמצעות תנאים מקרוב לחקות את התנאים הטבעיים שבהם צמחים מותקפים על ידי פתוגנים.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging at JoVE.com

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

assessing-stomatal-response-to-live-bacterial-cells-using-whole-leaf

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.2K Views.  University of Texas at Arlington. פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

Video: Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...