1. חשיבותה של ספירת Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים הוא צעד הכרחי אך מייגע עבור התרבות תאים במבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוזים תא עקבי להבטיח שחזור דיוק ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים חשובים לניטור תקינות התא קצב התפשטות, להערכת הנצחה או טרנספורמציה, זריעת תאים transfection, בניסויים הבאים או זיהום, והכנה לקראת מבחני מבוססי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות הצורך המהירות והדיוק בספירת התאים, 71% של 400 חוקרים שנסקרו לספור תאים באמצעות hemocytometer. בעוד hemocytometry הוא זול, זה מייגע ובכפוף הטיה משתמש לרעה, שתוצאתה ספירות מדויקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקורות שגיאה hemocytometry כוללים: חלוקת התא אחידות במדגם, יותר מדי או מעט מדי תאים במדגם, החלטות סובייקטיבית, אם תא נתון נופל בתוך השטח שהוגדר הספירה, זיהום hemocytometer, המשתמש אל המשתמש וריאציה ו וריאציה של קצב hemocytometer מילוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על השעמום הקשורים לספור ידני, 29% מכלל החוקרים לספור תאים באמצעות מכשירים אוטומטיים תא הספירה. עם זאת, עבור רוב החוקרים, מחיר הקשורים אלה הספסל העליון מכשירים גדולים היא מחסום להשתמש שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מונה תא שרביט השלטון הוא מכשיר כף יד אוטומטית מציעה אוטומציה הדיוק של הספירה קולטר במחיר נמוך יחסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערכת מעסיקה את העיקרון של גילוי קולטר עכבה מבוססי החלקיקים בפורמט מיניאטורי באמצעות שילוב של חומרה אנלוגי ודיגיטלי עבור חישה, עיבוד אותות, אחסון נתונים, וכן תצוגה גרפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיישן הפנויה מתוכנן עם אזור microfabricated תא חישה, המאפשרת אפליה לפי גודל התא, נפח תא בבית תת מיקרון ותת picoliter החלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משופרים עם הנוזל טיפול ערוצי דיוק אלקטרוניקה, הדלפק תא שרביט השלטון גרפית מציג האוכלוסייה הסטטיסטיקה תא כמו היסטוגרמה. </li></ol> 2. הכנת מתלה יחיד תא עבור ספירת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש הדלפק תא שרביט, להתחיל לדלל השעיה תא בודד של תאים, פוספט שנאגרו מלוחים. ריכוז של 10,000-500,000 תאים לכל מ&quot;ל הוא אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μL של תאים בדילול לצינור mL 1.5 microfuge. </li></ol> 3. ביצוע ספירת תאים באמצעות את שרביט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך על הדלפק תא שרביט השלטון על ידי לחיצה ארוכה על מתג בצד האחורי של המכשיר ולחכות ההוראות שעל המסך יופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תתבקש, לצרף חיישן לסוף יחידה את שרביט עם פאנל האלקטרודה חישה הפונים לעבר החלק הקדמי של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיישנים שרביט מורכב תא יצוק דיוק הדגימה, עם אזור חישה אלקטרוניים משולבים תא חישה אלקטרודות. החיישנים מאפשרים להפלות גודל התא בכל תת מיקרון רזולוציה, נפח תא ברזולוציה משנה picoliter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנדסה חיישן עקבי, מבטיח כרכים מדגם שווה נספרים מדידות גודל מדויק נעשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החיישן מחוברת, לבצע כל שלב של תהליך ספירת על פי ההוראות המופיעות על המסך כדלקמן: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המסך קורא &quot;החזק את הבוכנה להתחיל,&quot; לוחץ על המתג. המסך אז יהיה לקרוא &quot;להטביע את החיישן.&quot; להטביע את החיישן לתוך הפתרון ההשעיה התא ולשחרר את הבוכנה כדי לשאוב את ההשעיה התא לתוך החיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבוכנה משמשת האות החשמלי ו ימשוך את המדגם בתוספת נפח מת לתוך החיישן. המהירות או הדיוק של צולל לא משנה כפי שהיא עושה עם pipetting. תהליך זה יקח כמה שניות. כאשר מוכן, המכשיר יצפצף, ו &quot;לדוגמה טעון&quot; יוצג על המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם הוא נטען לתוך החיישן הוא נמשך דרך אזור חישה להעריך גודל התא ונפח תא, אז דרך microchannels. לאחר 50 μL המדגם נספר חיישן מספרת את המכשיר כדי להפסיק לספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ספירת תושלם, המסך של המכשיר יקרא &quot;הרוזן השלם. הסר חיישן וזורקים&quot;. בצע את הפקודה, ולהסיר ולסלק את החיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשיר לאחר מכן להציג היסטוגרמה של גודל התא או קוטר על המסך שלה, כמו גם את ריכוז התאים לכל מ&quot;ל. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הספירה הוא להשלים את ההיסטוגרמה מוצגת על המכשיר, להחיל השערים על ידי לחיצת כפתור לעבור. בחר &quot;gating אוטומטי&quot; או &quot;שימוש אחרון&quot; או כדי להגדיר באופן אוטומטי את השער מבוסס על הפרופיל היסטוגרמה, או להשתמש השערים מהסכום הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלי קשר הבחירה, השערים ניתן להעביר באופן ידני כדי לכוונן את הנתונים. לחצו על הכפתור לעבור שוב כדי לבחור את השער השמאלי כדי לגלולggle לעבור את השער כרצונכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז ללחוץ על לעבור שוב כדי להפעיל את השער הנכון המגילה לעבור למקום את השער הנכון. לחץ שוב; תא חדש הריכוז הממוצע נפח תא בקוטר יוצג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן גם לעבור לגור צד להחליף את התצוגה בין התאריך, השעה, כלומר גודל התא, כלומר נפח התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד 72 היסטוגרמות יכול להיות מאוחסן על המכשיר עצמו. כדי להעלות את הנתונים למחשב אישי, לצרף את המכשיר דרך יציאת כבל ה-USB על מסך התצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, לחיצה כפולה על יישום התוכנה שרביט השלטון כדי להפעיל את התוכנה ואז ללחוץ על &quot;חיבור&quot;. ספירת הכל באופן אוטומטי יציאת התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת היישום מציג את שרביט השלטון היסטוגרמה המפרט את התפלגות האוכלוסייה של התרבות בנפח או קוטר. קבצים שהורדו לאחר מכן ניתן לייצא ל-Microsoft Excel, שם את הנתונים הגולמיים יוצג פחי בקטרים ​​של התא שצוין או אמצעי אחסון נייד. </li></ol> 5. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשע עשרה שורות תאים שונות מוכנים לספור ריכוזי החל תיאורטי נקבעו באמצעות מונה קולטר. המתלים האלה התא היו אז מדולל יותר כדי להשיג השעיות התא בריכוזים התא התיאורטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגד התא שרביט השלטון היה אז בשימוש כדי לקבוע ריכוזי התא. איור 1 מציג 5 דילולים כי נמדדו 5 שורות תאים נציג יחד עם ריכוז התא התיאורטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמה גבוהה של ליניאריות כפי שצוין על ידי ערכי R2, מוכיח כי ספירת שרביט השלטון היא שיטה אמינה של שורות תאים שנבדקו, על פני מגוון רחב ההפעלה ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדיוק היחסי הכולל של ספירת שרביט השלטון לידי ביטוי באיור 2, שבו נתונים המתקבלים ספירת שרביט השלטון מושווים עם ספירת המתקבל ספירת קולטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומן של ספירת שרביט השלטון התא זממו נגד ביומן של ספירת קולטר, מראה כי, בכל שורות תאים שנבדקו, ספירת שרביט השלטון להתאים ספירת קולטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת של 19 שורות תאים בוצעו באמצעות קולטר Z2 מונה, המונה תא שרביט, מונה מבוסס חזון אוטומטי כגון סלולרי וי או מערכת אינספור, וגם hemocytemeter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת בוצעו על פי הוראות היצרן, תוך שימוש באותו התא החל ההשעיה ו דילולים זהה. התוצאות באיור 3 מראות כי ריכוז התאים נמדד על ידי ספירת שרביט השלטון מקרוב להתאים ריכוזי תא תיאורטי עם ליניאריות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדם אחוז וריאציה, או קורות חיים, חושבה עבור כל דילול של כל שורה תא עבור כל מערכת הספירה. איור 4 מראה את קורות% בממוצע על פני 19 שורות תאים ביחס ריכוז התא שיטת הספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטווח ההפעלה, הדלפק תא שרביט השלטון מדויקת יותר לספור hemocytometer מבוסס חזון, הצגת סטיות תקן קטנות מקדמי הממוצע קטן יותר של וריאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת שרביט פי עשרה מהר יותר ומהר יותר hemocytometry דלפקי אוטומטיות אחרות. ב איור 5, SF9, MCF7, ו HEK293 תאים נספרו בשיטות המתוארות וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן הממוצע הנדרש כדי למדוד את ריכוז התאים נרשם. שים לב hemocytometry בוצע פעם אחת בלבד לכל המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרביט עושה מדידות על בסיס גודל התא. לפיכך שינויים במורפולוגיה הסלולר ניתן ללכוד בהיסטוגרמה. תרבויות בריא להציג פעמון גאוס נחמד בצורת ההפצה, בעוד תאים בריאים, lyse, ולגרום לשינוי בהיסטוגרמה שמאלה (איור 6, פאנל משמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, כאשר אוכלוסיה של תאים מתים 50% היו מעורבים עם תאים חיים 50%, משמרות היסטוגרמה נצפו גם (איור 6, פאנל מימין). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig1.jpg" alt="איור 1" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig2.jpg" alt="איור 2" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig3.jpg" alt="איור 3" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig4.jpg" alt="איור 4" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig5.jpg" alt="איור 5" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig6.jpg" alt="איור 6" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig7.jpg" alt="איור 7" />

<ol>
	<li>Barghshoon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Counting Survey. , (2009).</li><li>Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+hybridoma+cell+number,+viability,+and+morphology+using+fully+automated+image+analysis.">Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis.</a> Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).</li><li>Houwen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. , (2003).</li></ol>

קתלין Ongena, Chandreyee דאס, ג&#39;נט ל סמית, סוניה גיל, ו גרייס ג&#39;ונסטון מועסקים על ידי Millipore, אשר מייצר את המכשירים המשמשים במאמר זה.

השוואת הביצועים של הדלפק תא שרביט השלטון על תוצאות שיטות ספירה אחרות, אנו מסיקים כי הנגד החדש כף יד, תא אוטומטי מספקת ספירת תא מדויק, מהיר, אמין על פני טווח רחב ההפעלה. הפונקציונליות של ספירת שרביט השלטון היא תוצאה של הטכנולוגיה דיוק מהונדסים מוטבע קצה החיישן ואת מכשור מתוחכם ספירת המבוסס על העיקרון קולטר. איכות הביצועים עולה שרביט השלטון בספירת כשיטה כדי להגדיל את המהירות ולשפר את שחזור של תא המבוססת על מבחני. הפורמט מאפשר שעמום כף יד ימין ספירה מהירה חינם למכסה המנוע תרבית תאים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> שרביט 2.0 מונה כף יד סלולריים אוטומטי עם 40 חיישנים שרביט השלטון מיקרומטר </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20040 </td><td></td></tr><tr><td> שרביט 2.0 מונה כף יד סלולריים אוטומטי עם 60 חיישנים שרביט השלטון מיקרומטר </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20060 </td><td></td></tr><tr><td> שרביט חיישנים, 60 מיקרומטר </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC60050 </td><td> 50 חבילות של חיישנים </td></tr><tr><td> שרביט חיישנים, 40 מיקרומטר </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC40050 </td><td> 50 חבילות של חיישנים </td></tr><tr><td> מתאם מתח אוניברסלי </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCPOWER </td><td> </td></tr><tr><td> שרביט O-Ring Kit </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCOCLIP </td><td> 2 טבעות אטימה ואחד לכסות מסנן </td></tr></tbody></table>

determining cell number during cell culture using the scepter cell counter

ספירת התאים לרוב צעד הכרחי אך מייגע על התרבות תאים במבחנה. ריכוזים תא עקבי להבטיח שחזור דיוק ניסיוני. ספירת תאים חשובים לניטור תקינות התא קצב התפשטות, להערכת הנצחה או טרנספורמציה, זריעת תאים transfection, בניסויים הבאים או זיהום, והכנה לקראת מבחני מבוססי תאים. חשוב כי ספירת התאים להיות מדויק, עקבי, ומהר, במיוחד עבור מדידות כמותיות של התגובות הסלולר. למרות הצורך הזה המהירות והדיוק בספירת התאים, 71% מכלל 400 חוקרים שנסקרו 1 אשר לספור תאים באמצעות hemocytometer. בעוד hemocytometry הוא זול, זה מייגע ובכפוף הטיה משתמש לרעה, שתוצאתה ספירות מדויקות. Hemocytometers עשויים זכוכית אופטית מיוחדת אשר השעיות תא נטענים בכמויות שצוינו וספר תחת מיקרוסקופ. מקורות שגיאות hemocytometry כוללים: חלוקת התא אחידות במדגם, יותר מדי או מעט מדי תאים במדגם, החלטות סובייקטיבית, אם תא נתון נופל בתוך השטח שהוגדר הספירה, זיהום hemocytometer, המשתמש אל המשתמש וריאציה ו וריאציה של hemocytometer מילוי שיעור 2. כדי להקל על השעמום הקשורים לספור ידני, 29% מכלל החוקרים לספור תאים באמצעות תא ספירה אוטומטיות התקנים; אלה כוללות מבוססות ראיה דלפקים, מערכות לזהות תאים באמצעות עקרון קולטר, או cytometry זרימה 1. עבור רוב החוקרים, המכשול העיקרי באמצעות מערכת אוטומטית הוא המחיר הקשורים benchtop אלה מכשירים גדולים 1. מונה תא שרביט השלטון הוא מכשיר כף יד אוטומטית מציעה אוטומציה הדיוק של הספירה קולטר במחיר נמוך יחסית. המערכת מעסיקה את העיקרון של גילוי קולטר עכבה מבוססי החלקיקים 3 בפורמט מיניאטורי באמצעות שילוב של חומרה אנלוגי ודיגיטלי עבור חישה, עיבוד אותות, אחסון נתונים, תצוגה גרפית. טיפ הפנויה מתוכנן עם אזור microfabricated תא חישה, המאפשר אפליה על ידי גודל התא ונפח התא תת מיקרון ותת picoliter החלטה. משופרים עם הנוזל טיפול ערוצי דיוק אלקטרוניקה, הדלפק תא שרביט השלטון דוחות האוכלוסייה תא הסטטיסטיקה מוצגים בצורה גרפית כמו היסטוגרמה.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter at JoVE.com

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

מונה Cell שרביט השלטון הוא מכשיר כף יד אוטומטיים שניתן להשתמש בהם כדי לספור תאים, צג בקוטר של התא נפח לשמש כדי לבדוק את בריאות ואיכות הסלולר אוכלוסיות מתרבות אחת לאחרת.

קביעת מספר נייד במהלך תרבית תאים באמצעות מונה Cell שרביט השלטון

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

determining-cell-number-during-cell-culture-using-scepter-cell

Research

JoVE Journal

Biology

37.9K Views.  Millipore Inc. מונה Cell שרביט השלטון הוא מכשיר כף יד אוטומטיים שניתן להשתמש בהם כדי לספור תאים, צג בקוטר של התא נפח לשמש כדי לבדוק את בריאות ואיכות הסלולר אוכלוסיות מתרבות אחת לאחרת.

Video: Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

ספירת אדם בתאי גזע עצביים

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

קביעת ספירת תאים יונקים, גודל התא ובריאות נייד באמצעות ת Moxi מיני מונה אוטומטי Cell

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול לתרבות משותפת של ציאנובקטריה מפרישה סוכרוז עם שותפים פטרייתיים

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being explored as a method for solar-driven bioproduction. One approach involves the use of CO2-fixing cyanobacteria that secrete organic carbon to support the metabolism of a co-cultivated heterotroph, which in turn transforms the carbon into higher-value goods or services. In this protocol, a technical description to assist the experimentalist in the establishment of a co-culture combining a sucrose-secreting cyanobacterial strain with a fungal partner(s), as represented by model yeast species, is provided. The protocol describes the key prerequisites for co-culture establishment: Defining the media composition, monitoring the growth characteristics of individual partners, and the analysis of mixed cultures with multiple species combined in the same growth vessel. Basic laboratory techniques for co-culture monitoring, including microscopy, cell counter, and single-cell flow cytometry, are summarized, and examples of nonproprietary software to use for data analysis of raw flow cytometry standard (FCS) files in line with FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) principles are provided. Finally, commentary on the bottlenecks and pitfalls frequently encountered when attempting to establish a co-culture with sugar-secreting cyanobacteria and a novel heterotrophic partner is included. This protocol provides a resource for researchers attempting to establish a new pair of co-cultured microbes that includes a cyanobacterium and a heterotrophic microbe.

<meta charset="utf8"></head><body>הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

This protocol provides a comprehensive guideline for the setup and quantitative monitoring of co-cultures, including photoautotrophic sugar-secreting cyanobacteria and heterotrophic yeasts.

הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Bioengineering

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

קביעת מספר נייד במהלך תרבית תאים באמצעות מונה Cell שרביט השלטון

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ספירת אדם בתאי גזע עצביים

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

קביעת ספירת תאים יונקים, גודל התא ובריאות נייד באמצעות ת Moxi מיני מונה אוטומטי Cell

הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד