1. L&#39;importance de comptage cellulaire <ol><li> Cellules de comptage est une étape nécessaire mais fastidieux pour en culture de cellules in vitro. </li><li> Concentrations cellulaires compatibles assurer la reproductibilité et la précision expérimentale. </li><li> Numérations cellulaires sont importantes pour la surveillance de la santé des cellules et le taux de prolifération, d&#39;évaluer l&#39;immortalisation ou la transformation, l&#39;ensemencement des cellules d&#39;ultérieures expériences, la transfection ou infection, et la préparation des tests cellulaires. </li><li> Malgré le besoin de rapidité et de précision dans le comptage de cellules, 71% des 400 chercheurs interrogés comptent cellules en utilisant un hématimètre. Bien hemocytometry est peu coûteux, il est laborieux et soumis à des biais d&#39;utilisateur et l&#39;utilisation abusive, ce qui entraîne compte inexactes. </li><li> Sources d&#39;erreur dans hemocytometry incluent: la distribution inégale des cellules dans l&#39;échantillon, trop ou trop peu de cellules dans l&#39;échantillon, les décisions subjectives quant à savoir si une cellule donnée relève du domaine défini comptant, la contamination de l&#39;hématimètre, l&#39;utilisateur à utilisateur de variation , et la variation du taux de remplissage de hémocytomètre. </li><li> Pour remédier à l&#39;ennui associé à un comptage manuel, 29% des chercheurs compter les cellules en utilisant des dispositifs de comptage automatique de cellules. Toutefois, pour la plupart des chercheurs, le prix associé à ces grands instruments de paillasse est un obstacle à leur utilisation. </li><li> Le compteur de cellules sceptre est un dispositif automatisé de poche qui offre l&#39;automatisation et la précision du comptage Coulter, à un coût relativement faible. </li><li> Le système utilise le principe Coulter de détection de particules à base d&#39;impédance dans un format miniaturisé utilisant une combinaison de matériel analogique et numérique pour la détection, le traitement du signal, de stockage de données, et l&#39;affichage graphique. </li><li> Le capteur à usage unique est conçu avec une microfabriqué, cellule de détection de zone qui permet la discrimination par la taille des cellules et le volume des cellules au sous-micron et sous-picolitres résolution. </li><li> Avec une précision améliorée de manutention de liquides canaux et de l&#39;électronique, le compteur de cellules Sceptre affiche graphiquement des statistiques de la population de cellules sous forme d&#39;histogramme. </li></ol> 2. Préparation d&#39;une suspension monocellulaire pour le comptage <ol><li> Pour utiliser le compteur de cellules Sceptre, commencez par dilution d&#39;une suspension cellulaire unique de cellules, en tampon phosphate salin. Une concentration de 10,000-500,000 cellules par mL est optimale. </li><li> Transférer 100 ul de cellules diluées à un tube de 1,5 ml. </li></ol> 3. Exécution Comptage des cellules en utilisant le Sceptre <ol><li> Mettez le compteur de cellules Sceptre en appuyant sur le commutateur à bascule sur le dos de l&#39;appareil et d&#39;attendre les instructions apparaissent à l&#39;écran. </li><li> Lorsque vous êtes invité, joignez un capteur à la fin de l&#39;unité sceptre avec le panneau électrode de détection face vers l&#39;avant de l&#39;instrument. </li><li> Sceptre capteurs se composent d&#39;une chambre d&#39;échantillonnage moulé avec précision, avec une zone de détection électronique et intégré la cellule de détection des électrodes. Les capteurs permettent de discriminer la taille des cellules au sous-micron résolution, et le volume des cellules au sous-picolitres résolution. </li><li> D&#39;ingénierie de capteurs compatibles, assure que les volumes d&#39;échantillon égales sont comptés et les mesures de taille précises sont faites. </li><li> Une fois que le capteur est fixé, effectuer chaque étape du processus de comptage selon les instructions à l&#39;écran comme suit: </li><li> Lorsque l&#39;écran affiche &quot;Maintenez enfoncé le piston pour commencer,&quot; appuyer sur le piston. L&#39;écran sera alors lire &quot;immerger le capteur.&quot; Immerger le capteur dans la solution de suspension de cellules et libérer le piston pour aspirer la suspension cellulaire dans le capteur. </li><li> Le piston agit comme un signal électrique et va attirer l&#39;échantillon, plus le volume mort dans le capteur. La vitesse ou la précision de plonger n&#39;importe pas tant le fait avec pipetage. Ce processus prendra plusieurs secondes. Lorsque vous êtes prêt, l&#39;instrument émet un bip et &quot;échantillon chargé&quot; sera affiché sur l&#39;écran. </li><li> Une fois l&#39;échantillon est chargé dans le capteur, il est tiré à travers la zone de détection pour évaluer la taille des cellules et le volume des cellules, puis à travers les microcanaux. Une fois 50 ul d&#39;échantillon est compté le capteur indique l&#39;instrument pour arrêter le comptage. </li><li> Après le dépouillement terminé, l&#39;écran de l&#39;instrument va lire &quot;dénombrement complet. S&#39;il vous plaît supprimer de capteurs et les jeter.&quot; Suivez l&#39;invite, retirez et jetez la sonde. </li><li> L&#39;instrument va alors afficher un histogramme de la taille des cellules ou de diamètre sur son écran ainsi que la concentration de cellules par mL. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Après le décompte est terminé et l&#39;histogramme est affiché sur l&#39;instrument, appliquer portes en poussant le bouton à bascule. Sélectionnez «gating auto&quot; ou &quot;dernière utilisation&quot; soit automatiquement la porte en fonction du profil de l&#39;histogramme, ou d&#39;utiliser les portes de l&#39;comptage précédent. </li><li> Indépendamment de la sélection, les portes peuvent être déplacés manuellement pour affiner les données. Poussez le bouton à bascule de nouveau pour sélectionner la porte à gauche et à faire défiler laggle pour déplacer la grille comme désiré. </li><li> Ensuite, appuyez sur la bascule à nouveau pour activer la porte de droite et faites défiler la bascule de placer la porte de droite. Cliquez à nouveau, une nouvelle concentration de cellules, le volume moyen des cellules et le diamètre sera affichée. </li><li> La bascule peut également être déplacé de chaque côté pour basculer l&#39;affichage entre les date, heure, taille moyenne de la cellule, et le volume cellulaire moyen. </li><li> Jusqu&#39;à 72 histogrammes peuvent être stockées sur l&#39;appareil lui-même. Pour télécharger les données vers un ordinateur personnel, fixez l&#39;appareil via le port USB du câble sur l&#39;écran. </li><li> Sur le PC, double-cliquez sur l&#39;application du logiciel Sceptre pour lancer le logiciel puis cliquez sur &quot;Connect&quot;. Tous les chiffres seront automatiquement le port pour le logiciel. </li><li> Le logiciel d&#39;application Sceptre affiche l&#39;histogramme détaillant la répartition de la population de la culture en volume ou en diamètre. Les fichiers téléchargés peuvent ensuite être exportées vers Microsoft Excel, lorsque les données brutes seront affichés dans les bacs des diamètres de cellules spécifiée ou des volumes de cellules. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <ol><li> Dix-neuf lignées cellulaires différentes ont été préparées pour le comptage et théoriques concentrations de départ sont déterminées en utilisant un compteur Coulter. Ces suspensions cellulaires ont ensuite été dilués pour obtenir des suspensions cellulaires à des concentrations cellulaires théorique. </li><li> Le compteur de cellules Sceptre a ensuite été utilisée pour déterminer les concentrations cellulaires. La figure 1 montre que les dilutions 5 ont été mesurées pour cinq lignées cellulaires représentatives ainsi que la concentration cellulaire théorique. </li><li> Le haut degré de linéarité comme indiqué par les valeurs de R2, démontre que le comptage sceptre est une méthode fiable pour les lignées cellulaires testées, dans une large gamme de fonctionnement linéaire. </li><li> La précision relative globale de comptage sceptre est démontré dans la figure 2, dans lequel les données obtenues du comptage Sceptre sont comparés avec chiffres obtenus de comptage Coulter. </li><li> Le journal de la numération cellulaire sceptre est comploté contre le journal de la numération Coulter, et montre que, dans toutes les lignées cellulaires testées, compte Sceptre correspondre aux chiffres de Coulter. </li><li> Comtes de 19 lignées cellulaires ont été effectuées en utilisant un compteur Coulter Z2, le compteur de cellules Sceptre, un compteur automatisé basé sur la vision tels que Vi-Cell ou d&#39;un système innombrables, et un hemocytemeter. </li><li> Comptages ont été effectués conformément aux instructions du fabricant, en utilisant la même cellule de départ de suspension et des dilutions identiques. Les résultats présentés dans la figure 3 montrent que les concentrations mesurées par la cellule Sceptre compter correspondent étroitement les concentrations cellulaires théorique avec une grande linéarité. </li><li> Le coefficient de variation pour cent, ou CV, a été calculée pour chaque dilution de chaque lignée cellulaire pour chaque système de comptage. La figure 4 montre les CV% en moyenne plus de 19 lignées cellulaires à l&#39;égard de la concentration des cellules et la méthode de comptage. </li><li> Dans la plage de fonctionnement, le compteur de cellules sceptre est plus précis que le comptage hémocytomètre vision fondée, en affichant plus petits écarts-types et les petits coefficients de variation moyen. </li><li> Compter sceptre est dix fois plus vite que hemocytometry et plus vite que d&#39;autres compteurs automatiques aussi. Dans la figure 5, SF9, MCF7, et les cellules HEK293 ont été comptés en utilisant les méthodes décrites dans cette vidéo. </li><li> Le temps moyen nécessaire pour mesurer la concentration cellulaire a été enregistré. Notez que hemocytometry a été réalisée qu&#39;une seule fois par échantillon. </li><li> Sceptre fait des mesures basées sur la taille des cellules. Ainsi tout changement dans la morphologie cellulaire peuvent être capturés dans l&#39;histogramme. Cultures santé à afficher une cloche en forme de belle distribution gaussienne, tandis que les cellules insalubres, Lyse, et provoquer un changement dans l&#39;histogramme vers la gauche (figure 6, panneau de gauche). </li><li> De même, quand une population de 50% de cellules mortes ont été mélangés avec 50% des cellules vivantes, des changements ont également été observées histogramme (figure 6, panneau de droite). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig1.jpg" alt="Figure 1" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig2.jpg" alt="Figure 2" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig3.jpg" alt="Figure 3" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig4.jpg" alt="Figure 4" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig5.jpg" alt="Figure 5" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig6.jpg" alt="Figure 6" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig7.jpg" alt="Figure 7" />

<ol>
	<li>Barghshoon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Counting Survey. , (2009).</li><li>Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+hybridoma+cell+number,+viability,+and+morphology+using+fully+automated+image+analysis.">Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis.</a> Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).</li><li>Houwen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. , (2003).</li></ol>

Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sonia Gil, et Grace Johnston sont employés par Millipore, qui produit des instruments utilisés dans cet article.

En comparant la performance du compteur de cellules Sceptre aux résultats d&#39;autres méthodes de comptage, nous concluons que cette nouvelle console portable, compteur de cellules automatisé fournit numération cellulaire précise, rapide et fiable sur une large plage de fonctionnement. La fonctionnalité de comptage sceptre est un résultat de la technologie de précision conçu intégrés dans l&#39;extrémité du capteur et de l&#39;instrumentation sophistiquée comptant basée sur le principe Coulter. La qualité des performances suggère Sceptre comptant comme méthode pour augmenter la vitesse et améliorer la reproductibilité des tests cellulaires. Le format de poche permet de l&#39;ennui rapides droit libre à compter à la capuche de culture cellulaire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> Sceptre 2,0 Compteur de cellules automatisé de poche avec 40 capteurs Sceptre um </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20040 </td><td></td></tr><tr><td> Sceptre 2,0 Compteur de cellules automatisé de poche avec 60 capteurs Sceptre um </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20060 </td><td></td></tr><tr><td> Capteurs Sceptre, 60 um </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC60050 </td><td> 50 Pack de capteurs </td></tr><tr><td> Capteurs Sceptre, 40 um </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC40050 </td><td> 50 Pack de capteurs </td></tr><tr><td> Adaptateur secteur universel </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCPOWER </td><td> </td></tr><tr><td> Sceptre O-Ring Kit </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCOCLIP </td><td> 2 joints toriques et un couvercle de filtre </td></tr></tbody></table>

determining cell number during cell culture using the scepter cell counter

Comptage des cellules est souvent une étape nécessaire mais fastidieux pour en culture de cellules in vitro. Concentrations cellulaires compatibles assurer la reproductibilité et la précision expérimentale. Numérations cellulaires sont importantes pour la surveillance de la santé des cellules et le taux de prolifération, d&#39;évaluer l&#39;immortalisation ou la transformation, l&#39;ensemencement des cellules d&#39;ultérieures expériences, la transfection ou infection, et la préparation des tests cellulaires. Il est important que numérations cellulaires sont exactes, cohérentes et rapides, en particulier pour des mesures quantitatives des réponses cellulaires. Malgré ce besoin de rapidité et de précision dans le comptage des cellules, 71% des 400 chercheurs interrogés qui comptent une des cellules en utilisant un hématimètre. Bien hemocytometry est peu coûteux, il est laborieux et soumis à des biais d&#39;utilisateur et l&#39;utilisation abusive, ce qui entraîne compte inexactes. Hemocytometers sont faites de verre optique spécial sur lequel les suspensions cellulaires sont chargés dans des volumes spécifiés et comptés sous un microscope. Sources d&#39;erreurs dans hemocytometry incluent: la distribution inégale des cellules dans l&#39;échantillon, trop ou trop peu de cellules dans l&#39;échantillon, les décisions subjectives quant à savoir si une cellule donnée relève du domaine défini comptant, la contamination de l&#39;hématimètre, l&#39;utilisateur à utilisateur de variation , et la variation du taux de remplissage hémocytomètre 2. Pour remédier à l&#39;ennui associé à un comptage manuel, 29% des chercheurs compter les cellules en utilisant des cellules de comptage automatique des dispositifs; s&#39;agit notamment basé sur la vision des compteurs, les systèmes qui détectent les cellules en utilisant le principe Coulter, ou une cytométrie en flux. Pour la plupart des chercheurs, le principal obstacle à l&#39;utilisation d&#39;un système automatisé est le prix associé à ces grands instruments de paillasse 1. Le compteur de cellules sceptre est un dispositif automatisé de poche qui offre l&#39;automatisation et la précision du comptage Coulter, à un coût relativement faible. Le système utilise le principe Coulter de détection de particules à base d&#39;impédance 3 dans un format miniaturisé utilisant une combinaison de matériel analogique et numérique pour la détection, le traitement du signal, le stockage de données, et l&#39;affichage graphique. L&#39;embout jetable est conçu avec une microfabriqué, cellule de détection de zone qui permet la discrimination par la taille des cellules et le volume des cellules au sous-micron et sous-picolitres résolution. Avec une précision améliorée de manutention de liquides canaux et de l&#39;électronique, le compteur de cellules Sceptre des rapports statistiques sur la population de cellules affichées graphiquement sous forme d&#39;histogramme.

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Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Le compteur de cellules sceptre est un appareil portatif automatisé qui peut être utilisée pour compter les cellules, surveiller diamètre cellulaire et le volume, et être utilisée pour vérifier la santé et la qualité des populations cellulaires d&#39;une culture à l&#39;autre.

Déterminer le nombre de cellules pendant la culture cellulaire en utilisant le compteur cellulaire Sceptre

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.8K vues.  Millipore Inc. Le compteur de cellules sceptre est un appareil portatif automatisé qui peut être utilisée pour compter les cellules, surveiller diamètre cellulaire et le volume, et être utilisée pour vérifier la santé et la qualité des populations cellulaires d'une culture à l'autre.

Vidéo: Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Les cellules ES humaines: la culture à partir de cellules congelées

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Recherche

Biologie

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à l&#39;aide du Moxi Mini Z Compteur de cellules automatisé

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Suivi cellule à l&#39;aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Comparaison de trois différentes méthodes pour la détermination de la prolifération cellulaire dans des lignées cellulaires de cancer du sein

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.