מחקר זה נתמך על ידי תרומות של תוכנית המחקר הזדמנויות לתואר ראשון ב UCI (AR ו-SP) ומענקים ממדינת קליפורניה יוזמת מחלת אלצהיימר לבין המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב להעניק אין. HD38466, מחקר מחלת האלצהיימר מרכז המענק לא. AG16573 (JB)

1. Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים חומר הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שנאגרו 1X של האנק תמיסת מלח (HBSS) על ידי דילול לפתרון מניות 10X במים סטריליים (01:09). חנות HBSS ב 4oC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% בינוני DMSO הקפאת ידי דילול DMSO ב HBSS (01:09). המדיום הקפאת צריכה להיעשות טרי לפני cryopreservation ומאוחסן על 4oC עד צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכין גילוח פלדה משמשת קיצוץ שיטתי של הרקמה. לפני השימוש, סכין הגילוח הוא מעוקר ידי והשקיעה אתנול 70% עבור שעות 2. מיד לפני עיבוד רקמות, יש לשטוף את הסכין עם מים סטריליים 3 פעמים. הימנע עוזבים את הסכין במים סטריליים בסכום מופרז של זמן, כפי שהוא נוטה חמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל הקפאה Nalgene טעון cryovials (2.5 מ&quot;ל) ולאחר מכן הביא לתוך ארון ביולוגי סטרילי. 1 מ&quot;ל של מדיום הקפאת צונן מתווסף בקבוקון אחד. מיכל הקפאה ממוקם אז לפחות 2 שעות בשעה 4oC. </li></ol> ניקוי, קיצוץ, ועל הקפאת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת המוח להיות קפוא הוא ניקה של קרום קרום המוח וכלי הדם. השתמש טיפים מחט סטרילית כדי להסיר בזהירות פסולת הרקמה תוך כדי עבודה על גבי שקית קוביות קרח. רקמה נוקה יש לשטוף קלות HBSS קר הועבר בצלחת פטרי חדש קיצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה על גבי שקית קוביות קרח, השתמש סכין גילוח לעקר במהירות כדי לקצוץ את הרקמה לתוך כ 1 3 בלוקים מ&quot;מ. עבודה עם מנות קטנות של רקמה לנקות את תוצאות זמן שליטה טובה יותר על הליך החיתוך, וכתוצאה מכך גדלים גוש אחיד יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף רקמה קצוץ לתוך 50 מ&quot;ל של HBSS בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל. בעדינות ולשטוף את צלחת פטרי עם HBSS כדי לאסוף כל גושי רקמה הנותרים. אפשר גושי רקמה לרדת לחלק התחתון של הצינור, יצירת רקמה ארוזים בצורה רופפת לחסום גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הרקמה שיקוע, להביא את מיכל הקפאה מקורר בעבר cryovials לתוך ארון הבטיחות הביולוגית. פותח את הפקק כל cryovials כדי לזרז את התהליך של הוספת רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל את גושי רקמה התיישבו, לשאוב בעדינות HBSS עודף, משאיר שכבה דקה מאוד של המדיה מעל גלולה. צנטריפוגה אינה מומלצת, מכיוון שהדבר יגרום גושי רקמה לדבוק זה בזה, הולכת ופוחתת באופן משמעותי את יעילות מקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לאסוף 200 μL מהחלק התחתון של הרקמה רפויה לחסום גלולה באמצעות קצה פיפטה עם פתחים רחבים (לחתוך קצה במספריים סטריליות). העברת את החומר cryovial אחד לעבור הרקמה, הבא שוב איסוף מהחלק התחתון של גלולה. זה חיוני כי ההליך כולו הקצאת רקמה לא לוקח יותר מ 3-4 דקות לכל מיכל ההקפאה. הדבר מבטיח כי רקמות חשוף DMSO לתקופה רק זמן קצר לפני ההקפאה. לאחר העברת רקמה על צלוחיות, במקום מיכל הקפאה במקפיא-80oC במשך לפחות 4 שעות. לחלופין, מיכל הקפאת ניתן להשאיר ולינה -80 מעלות. חזור על תהליך זה עבור כל מיכלי הקפאה הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את cryovials ממיכל ההקפאה (ים) cryobox ובמקום במיכל חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol> 2. הפשרה ו culturing של בלוקים קפואים רקמות קליפתיים חומר הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני ההפשרה דגימות רקמה, poly-L-ליזין צלחות פטרי מצופה / coverslips מוכנים. באופן כללי, עבור נוירונים בקליפת המוח אנו מכינים מאכלים מצופה 500 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​או 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הוסף מספיק poly-L-ליזין פתרון (שנעשו חיץ borate) באופן מלא לכסות את החלק התחתון של המנה. אם coverslips זכוכית נדרשים, להבטיח כי הם שקועים לחלוטין מתחת פתרון poly-L-ליזין. דגירה של לפחות 12 שעות. לפני השימוש, לשטוף ביסודיות את הכלים עם כמות ליברלית של מים סטריליים 3 פעמים, 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS חם משמש לניקוי הרקמות מופשר, וכן לנתק את הרקמה השעיות לתוך התא. נפח HBSS צורך ישתנה בהתאם לכמות רקמות להיות מופשר, אבל בדרך כלל 1 cryovial מדללים ב 50 מ&quot;ל של HBSS ויהיה ניתק ב 10 מ&quot;ל של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי של Dulbecco בינוני הנשר עם 10% ברזל בתוספת שור עגל בסרום (EBS) ו -1% אנטיביוטי / antimycotic (AA) תערובת (DMEM (++)) צריך להיות ממוקם בתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ציפוי (NB (+++)) צריכה להיעשות טרי לפני השימוש. בינוני זה הוכן על ידי הוספת 1% אנטיביוטי / antimycotic בתוספת B27 ותוספי N2. </li></ol> הערה: שמות מדיה שצורפה צלבים (+) מצביעים על הכללת תוספי הרכב הבסיס של התקשורת. בטקסט הזה, DMEM (+ +) מציין DMEM EBS פלוס 10% פלוס 1% AA, בעוד NB (+++) מציין NB plלנו 1% AA פלוס B27 פלוס N2. הפשרה ו culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את cryovials מהטנק חנקן נוזלי במהירות להפשיר על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד רק קרח גלולה קטנה הוא ציין את הבקבוקון בתוך התוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את תוכן הבקבוקון 50 מ&quot;ל של HBSS חם צינור חרוטי. השתמש קצה פתח רחב בעדינות כדי לסלק כל גושי רקמה שנותר תקוע cryovial. הפוך את הצינור 3-4 פעמים ולאפשר הרקמה לאט לאסוף בתחתית. רקמות צריכה להתיישב מהר, אבל אם בלוקים קטנים מדי זה לא יכול להתרחש ואור צנטריפוגה (~ 200 x ז) ​​מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב HBSS עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של HBSS חם רקמת גלולה ו 300 μL של טריפסין 0.25% ו 50 μL של DNAase. דגירה של אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים במשך 5 דקות, ולאחר מכן מקום שייקר מסלולית מוגדר 80 סל&quot;ד ו - 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופה זו, להביא את גושי רקמה לתוך ארון בטיחות ביולוגית להשתמש פיפטה 10 מ&quot;ל בזהירות להתסיס את גושי רקמה עד ההשעיה תא מעונן נוצר. לבטל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של DMEM חם (+ +) כדי השעיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ניתק ב 1200 x g עבור 5 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant, resuspend התא גלולה ב 10 מ&quot;ל של DMEM חם (+ +) ולכמת מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים פולי-L-ליזין מנות מצופה. בדרך כלל, מנה 60 מ&quot;מ יהיה מצופה 1x10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים לצרף צלחת / coverslips במשך שעה בערך 1 ב בתרבית רקמה חממה. מומלץ לעקוב אחר התקדמות מצורף צלחת אחת כל 10 דקות עד מצורף יעיל הוא ציין. ואז, בעדינות להחליף את מדיום עם טרי DMEM (++). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להחליף את DMEM (+ +) עם חם NB (+++). שינויים בינוני חלקית (50%) מתבצעות כל 5 ימים עם טרי NB (+++). תרבויות בריא בדרך כלל מראים סימנים של בידול וצמיחה של תהליכים לאחר 24 שעות. בתנאים אלה, וביצוע שינויים בינוני חלקית כל 4-5 ימים, התרבויות יכול להישמר במשך תקופות ממושכות של זמן עד 4-6 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדור של תאים עצביים מבשר (NPCs), פרוטוקול דומה משמש למעט שאחרי צנטריפוגה, DMEM ללא EBS משמש. תאים הם מצופה ב-T-25 צלוחיות ב DMEM/F12 (01:03) בתוספת B27 ו EGF (20 ng / mL) כדי לאפשר היווצרות של neuropheres. כדי לבדל את NPCs, neurospheres הם מצופה על laminin (10 UG / mL) coverslips מצופה DMEM/F12 (01:03) בינוני בתוספת N2. </li></ol> 3. נציג תוצאות תרבויות בריא תציג צמיחה בידול משמעותי לאחר 5 ימים שלאחר ההפשרה ובדרך כלל לייצב את הצמיחה שלה על ידי 10 ימים (איור 1). מכתים Immuncocytochemical של תרבויות אלה מגלה האסטרוציטים רבים (איור 2 א) ו נוירונים (תרשים 2B) הן האדם חולדה תרבויות עצבי ראשוני. פרוטוקול זה מתאים גם לדור של NPCs כמו ריחוף ללא neurospheres (איור 3A), אשר בתנאים הבחנה, תוצאה בתרבויות באיכות גבוהה מעורבת (איור 3B, C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בתרביות תאים של רקמות קפוא קליפת המוח האנושי. קפוא חוסם רקמת קליפת המוח האנושי הם מופשרים, מצופה על poly-ליזין coverslips מצופה גדל במשך 10 ימים. ביום 5 הרחבת התא ניכר וביום 10 confluency מושגת. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מכתים Immunocytochemical של תרביות תאים. (א) תרבויות הוכתמו החלבון סמן גליה גליה חומצי fibrillary (GFAP, חיצים עבה). (ב) נוירונים התגלו עם עצבי בטא טובולין סמן III (TIII, חיצים דקים). (ג) הן האדם בתרבויות עכברוש להראות גליה שפע נוירונים לאחר 10 ימים בתרבות. נוגדנים העיקרי: עכבר אנטי GFAP (1:1000) ו הארנב נגד TIII (1:1000). נוגדנים משני: אנטי עכבר Alexa 594 (1:500) ואנטי ארנב Alexa 488 (1:500). מכתים גרעינים: Hoestch כחול (1:1000). בר קנה מידה: 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. דור neurospheres. (א) הרקמה הקפואה היה מעובד כמתואר לעיל ואיפשר להפיץ כמו neurospheres. (ב) Neurospheres היו על coverslips מצופה זכוכית בתנאים המבדילים גדל במשך 10 ימים, וכתוצאה מכך התאים נודדות הרחק neurosphere. (ג) שני נוירונים האסטרוציטים נמצאים בשוליים של הרחבת neurosphere מבדל. Counterstaining גרעיני, נוגדנים ראשוניים ומשניים לשמש באיור 2.

<ol>
	<li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+brain+tissue.">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li><li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells.">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li><li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells.">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li><li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium.">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Cryopreservation מציע הזדמנות לבנק היקר דגימות רקמות המוח לשימוש עתידי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוטה אך יעילה ליצור שתי נוירון מועשר תרבויות תאים עצביים מאבני מבשר קפוא רקמות המוח. הליך זה חסכוני ימנע את העלויות של טכניקות מסורתיות cryopreservation לנצל יותר יקר שיעור שבשליטת מקפיאים. הפרוטוקול מאפשר לדור של תרבויות העצבית קיימא שלאחר ההפשרה על ידי מתן אמצעי מהיר אך יעיל להקפיא בלוקים רקמות. תהליך הקפאה כולו יכול לקחת קצת כמו 20 דקות. בנוסף תרבויות עצבי ראשוני, תוך שימוש בשיטה זו רקמת בלוקים יכולים גם להיות מופשר ליצור NPCs גדל כמו neurospheres צף חינם. בהקשר זה, היעדר נסיוב במדיום הקפאת שלנו מבטיחה כי התאים נשמרים במצב לא מובחן. בתנאים הבחנה, המיוצר neurospheres מהרחבת להראות קפוא רקמות שיעורי הבחנה דומה מאוד neurospheres שנוצר מרקמות טריות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995-073</td>
<td>High gluclose 1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine calf serum supplemented</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HYCLONE</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>For culture medium </td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1088-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>Supplement for Neurobasal medium</td>
</tr>
<tr>
<td>N2 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502-048</td>
<td>Supplement for Neurobasal medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro </td>
<td>25-054CI </td>
<td>Tissue dissociation</td>
</tr>
<tr>
<td>Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4527-30KU</td>
<td>Tissue dissociation</td>
</tr>
<tr>
<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14065</td>
<td>Cleaning tissue, washes, and freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-L-Lysine- 500mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P2636</td>
<td>Substrate for adhesion of neuronal cells</td>
</tr>
<tr>
<td>antibiotic-antimycotic (100X), liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240-062</td>
<td>To prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Large orifice pipette Tips (1-200 ul)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>02-681-141</td>
<td>To prevent shear stress to cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Graduated pipette tips (101-1000 ul)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1111-2721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>21 G1 precision guide needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickinson</td>
<td>305165</td>
<td>To clean tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml pipette </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1071-0810</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>926-9-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single edge razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Smith Brand</td>
<td>67-0238</td>
<td>To chop tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>100 x 15 mm polystyrene petri dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0010</td>
<td>For cleaning tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryogenic box </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5026-1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Freezing container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5100-0001</td>
<td>"Mr. Frosty"</td>
</tr>
<tr>
<td>2.0 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5012-0020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>D128-500</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol 200 proof</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E7023</td>
<td>For sterilizing razor blade</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cryopreservation of cortical tissue blocks for the generation of highly enriched neuronal cultures

במחקר זה, אנו המתאר פרוטוקול סטנדרטי עבור cryopreservation המוצלחת הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. עבור פרוטוקול זה המדיום הקפאת בשימוש הוא sulfoxide דימתיל 10% (DMSO) מדולל פתרון שנאגרו של האנק מלח (HBSS). בלוקים של רקמת קליפת המוח מועברים cryovials המכיל את המדיום מקפיא קפוא לאט ב -1 ° C / min במיכל שיעור שבשליטת מקפיא. לאחר ההפשרה עיבוד ניתוק של גושי רקמה קפוא המיוצר באופן עקבי העצבית מועשר תרבויות אשר הציגו צמיחה מהירה מדלקת עצבים במהלך 5 הימים הראשונים בתרבות הרחבה משמעותית של רשת נוירונים בתוך 10 ימים. מכתים Immunocytochemical עם חלבון סמן astrocytic גליה חומצי fibrillary (GFAP) ואת עצבי בטא טובולין סמן המעמד השלישי, גילה מספר רב של נוירונים האסטרוציטים בתרבויות. הדור של תאים עצביים תרבויות מבשר לאחר רקמות לחסום דיסוציאציה הביא המתרחב במהירות neurospheres, אשר הפיק מספר רב של נוירונים האסטרוציטים בתנאים מבדל. זה פרוטוקול cryopreservation פשוט מאפשר לשימור, מהיר ויעיל, ולא יקר של גושי רקמה קורטיקלית במוח, המעניק גמישות משופרת עבור דור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures at JoVE.com

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

כאן אנו מתארים שיטה יעילה cryopreservation הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. פרוטוקול זה פשוט מספק גמישות לדור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

cryopreservation-cortical-tissue-blocks-for-generation-highly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  University of California, Irvine. כאן אנו מתארים שיטה יעילה cryopreservation הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. פרוטוקול זה פשוט מספק גמישות לדור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

Video: Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

מערכת אוטומטי לחלוטין תכליתי מאוד עבור בדיקת ריבוי פונקציות קוגניטיביות ורישום פעילות עצבית במכרסמים

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...