מחקר זה מומן בחלקו על ידי קרן IPSEN. IMV היא האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן פרופ &#39;לביולוגיה מולקולרית, ואת הקתדרה ארווין וג&#39;ואן ג&#39;ייקובס במדעי החיים למופת. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH, Leducq Foundation, קרן Meriaux, אליסון רפואי הקרן, Ipsen / Biomeasure, סאנופי אוונטיס, סרטן הערמונית קרן, ואת ח&quot;נ ופרנסס ג קרן ברגר. PAS ממומנת על ידי הקרן קרן מק &#39;נייט למדעי המוח לבין המכון הלאומי לשימוש בסמים (R01 DA019022). המחברים מבקשים להודות מרק שמיט. אמנות גרפי תוכנן על ידי ג&#39;יימי טי סיימון. חסות סופק על ידי חביב Invitrogen.

1. תרבויות cerebellar Organotypic: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור בהצלחה תרבויות cerebellar organotypic להשתמש בעכברים בין P0-P3 או P8-P12. לצורך ניסוי שלנו השתמשנו עכברים בטווח P8-P12 כי זה שלב התפתחותי היה מתאים יותר במחקר שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את לנתיחה ואת בינוני תרבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה המוח והכנת פרוסה מתבצעות מלאכותית נמוך נוזל המוח והשדרה נתרן (ACSF) המכיל סידן כלוריד 1mm, 10mm D-גלוקוז, 4mm אשלגן כלורי, מגנזיום כלוריד 5mm, סודיום ביקרבונט 26mM, סוכרוז 246mM פתרון פנול אדום (1:1000) , pH 7.3. כדי לעקר את הפתרון, לסנן אותה דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות cerebellar הם בתרבית 75% מינימום בינוני הנשר חיוניים (ממ), 25% חום מומת סרום סוס, HEPES 25mm, 1mm גלוטמין, 5 מג / מ&quot;ל ​​גלוקוז, פניצילין (100 U / mL) וסטרפטומיצין (100 U / mL). סינון בינוני דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר שבועיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוח קר כקרח בינוני ACSF מבעבע בעבר עם Carbogen (95% חמצן ופחמן דו חמצני 5%) שים לב, כי הרוויה עם Carbogen תשנה את ה-pH של התמיסה כך יעבור מאדום לכתום. דיסקציה צריכה להתבצע במינימום זמן אפשרי נזהרים שלא לפגוע במבנה המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את המוח בסעיפים sagittal של 400 מיקרומטר באמצעות vibratome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך sagittal בסכין גילוח בהמיספירה אחת, מנסה לחתוך כמה שפחות של המוח הקטן, זה יספק משטח שטוח עבור חיתוך. קליפת המוח משמשת רק תמיכה על מנת להפוך את חיתוך קל אך מאז היא נושא חשוב זה נוח יותר לחתוך את החצי מקורי של קליפת המוח עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש cyanoacrylate (הפלא) כדי לתקן את המיקום של המוח על הצלחת vibratome מתכת. חשוב לצנן את הצלחת על הקרח לפני הוספת דבק להפיץ אותו היטב בעזרת קצה של הצינור כדי ליצור שכבת דבק דקה. אם יש עודף של הפלא, זה יהיה לנתק מהצלחת כשמדובר במגע עם ACSF ואת מדגם יאבדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוח מחובר הצלחת vibratome, מספיק להוסיף מדיה ACSF כדי לכסות את המוח לשים קרח מתחת הצלחת לשמור את זה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות 400 מיקרומטר ולהעביר אותם עם פיפטה פסטר מפלסטיק (לחתוך את קצה להרחיב אותו ולמנוע נזק פרוסות) אל צלחת 6-גם תא המכיל תרבות ACSF על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את המוח הקטן משאר חלקי המוח בעזרת שני מזרקים אינסולין (מזרקים עם קוטר קטן 28-מד מחטים) תחת המיקרוסקופ לנתח. כמה פרוסות יהיה הפלא המצורפת את הקצוות: זה הרגע כדי לנסות להסיר את זה כמו שזה יכול להשפיע על הכדאיות של הפרוסה. חשוב לעשות זאת בזהירות מבלי לפגוע במבנה המוח הקטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פרוסות cerebellar עד 6-30mm היטב צלחות המכילות צלחת מוסיף תרבות עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר. הוסף 1 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות לכל טוב, זה היה טרום מותנה הדגירה של לפחות 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2 (בתרבות תא חממה). מניחים את מוסיף על גבי מדיה לוודא שאין בועות אוויר שנלכדו מתחת ולאחר מכן למקם את פרוסות המוח הקטן (1-3 לכל הכנס) על גבי מוסיף לוודא שהם המורחבת מלא וכי אין נוזל מכסה אותם. לשאוב עודף של התקשורת במידת הצורך. לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 לשנות את התקשורת בכל תרבות 2 או 3 ימים. מומלץ להחליף רק חלק בינוני (למשל נפח ½) בבת אחת, שכן המדיום המשמש מכיל פרוסה הנגזרות trophic גורמים חשובים להישרדות התא. </li></ol> 2. פאס טיפול מכתים של Slices cerebellar: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי האתגר אפופטוטיים, אנחנו בתרבות הראשון פרוסות במשך 5 ימים שינוי התקשורת ביום במבחנה 3 (DIV3). ביום DIV5 תרבויות מטופלים עם 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Jo2 אגוניסט פאס נוגדן ידי הוספתו ישירות לתקשורת על מנת לקבל רקע נקי של מוות של תאים מאז השינויים של התקשורת יכול לגרום כמה התמותה התרבויות. מחצית הבארות הם מטפלים כפקדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות להסיר את המדיה מתחת מוסיף את ידי יניקה. כדי לתקן את הפרוסות, להוסיף 1 מ&quot;ל של קרים כקרח PFA 4% מתחת ו 1 מ&quot;ל לעיל להכניס את. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות להסיר את PFA לשטוף קצר עם PBS קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להסיר את PBS ולהוסיף 1 מתחת מ&quot;ל ו 1 מ&quot;ל לעיל להכניס של מתנול קר כקרח 20% PBS ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו שוב עם PBS ולהוסיף 1 מ&quot;ל ו 1 מ&quot;ל מתחת מעל להכניס את של 0.5% Triton-X-100 ב PBS עבור permeabilization. דגירה למינימום של 12 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר permeabilization, בלוק עם BSA 20% PBS עבור מינימום של4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. בשלב זה הפרוסות יכולים להישמר פתרון חסימת לפחות 3 ימים 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת כתם הפרוסות בזהירות לחתוך את פיסת קרום להכניס המצורפת הפרוסה cerebellar ולהעביר אותו 24 גם צלחות המכילות PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining נעשית ברצף, תחילה לשעה אחת ואז עם נוגדן Calbidin לילה עם מגיב TUNEL. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 250 μL את מגיב TUNEL לתוך זה גם לוודא שהוא מכסה את כל פני השטח של הפרוסה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה להסיר את תערובת TUNEL ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBS ולהוסיף 250 μL של דילול 1 / 1000 של הנוגדן Calbindin ב PBS ו דגירה לילה בשעה 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL של נוגדנים משני בדילול 1 / 500 ב PBS ו דגירה של לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר בחושך. הערכה TUNEL השתמשנו התווית TMR אדום, ולכן נוגדנים משני שלנו Calbindin הוא מצומדות כדי Alexa-488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS ואת ההר פרוסות גבי זכוכית מיקרוסקופ באמצעות התקשורת הרכבה המכיל DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה הפרוסות עם מיקרוסקופ confocal באמצעות 488 nm ו 561 nm עירור wavelenght עבור Calbindin ו TUNEL בהתאמה. </li></ol></li></ol> 3. נציג תוצאות: האתגר העיקרי של פרוטוקול זה להיות מסוגל ליצור בריא תרבויות פרוסה cerebellar, במיוחד מאז readout הסופי שלנו יהיה מוות של תאים. תרבות בריאה מופיע אחד שבו שכבת גוף התא הוא שקוף ומאפשר לך לראות את המבנה foliated של המוח הקטן מתחת למיקרוסקופ (איור 1). אחרי כמה ימים בתרבות פרוסות מתחילים התאים דק ולא נוירונים ניתן לצפות נודדות הרחק בשוליים של הפרוסה. התאים עגול כהה (מקרופאגים סביר ביותר) שמכסים את פרוסות אחרי כמה ימים בתרבות, בסופו של דבר לירידה במספר לאחר 10-14 ימים במבחנה (איור 2) 5. ההוכחה האולטימטיבית עבור לקיומה של פרוסות היא כתם על סמנים סלולריות שונות, כגון Calbindin עבור התאים פורקינג&#39;. איור 3 מראה תמונה נציג מיקרוסקופ confocal של שכבת תאים פורקינג&#39; עם גרעינים TUNEL מספר חיובי. חשוב לקחת בחשבון כי גם אם כמה פרוסות קיבל גירוי אפופטוטיים, הם נחשפו רק למשך 24 שעות. זה איפשר מספיק זמן כדי לבחון פיצול ה-DNA בתאים מתים עם מכתים את TUNEL, אבל תא מוגדר שכבת פורקינג&#39; עדיין נוכח. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. פרוסה cerebellar בריא DIV2. תמונה זו מציגה את תא שקוף הגוף שכבת ומבנה cerebellar foliated ב פרוסה בריא. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. פרוסה cerebellar בריא ב DIV 7. בתמונה זו אנחנו עדיין יכולים לראות את המבנה foliated של המוח הקטן ואת המראה של גופי התא כהה. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תמונה נציג פרוסה פאס שטופלו cerebellar. Confocal תמונה זו מראה את התאים פורקינג&#39; מוכתם Calbindin (ירוק) לבין תאים אפופטוטיים חיובית מכתים TUNEL (אדום). תאים פורקינג&#39; אינם מופיעים בשורה אחת, אלא מקובצים היוצרים מבנה דמוי folium.

<ol>
	<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures.">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures.">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li><li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Beat, H., G&#228;hwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. , 461-498 (1998).</li></ol>

לעבוד כל בעלי החיים שנערך נעשה בהתאם למדיניות שקבע IACUC. ממכון סאלק הוא מתקן מוכר AAALAC.

שיטה זו מתארת ​​את אחד יישומים אפשריים רבים של תרבויות organotypic עצבי והיא אפשרה לנו ללמוד את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים בסוג בר פרוסות cerebellar מוטציה. החלק הקריטי ביותר של ניסוי זה הוא להיות מסוגל לייצר בעקביות בריא תרבויות פרוסה cerebellar. הגורמים העיקריים הם לנתיחה וטכניקה לחתוך את היכולת לבצע את הפרוטוקול בזמן שפחות, אבל באותו הזמן נזהר לא לפגוע פרוסות. גורם נוסף חשוב הוא הכנה הרכב של התקשורת תרבות, תרבויות אלה רגישים מאוד, ולכן היינו צריכים לבדוק כמה מתכונים המותגים ואת התקשורת. גם קבוצות שונות של סרום או כל רכיב אחר של התקשורת להשפיע על הכדאיות של הפרוסות. קיבלנו את התוצאות הטובות ביותר עם סרום הסוס ממגרש Invitrogen # 480116. לאחר פרוסות cerebellar נוצרות אחד יכול ללמוד פיתוח cerebellar, electrophysiology, הישרדות התא לבד או בתגובה לגירויים אפופטוטיים, excitotoxicity או מחסור בחמצן. מחקרים השוואתיים באמצעות סוג בר פרוסות cerebellar מוטציה כבר תובנה מאוד בהיבטים רבים של פיתוח פונקציה cerebellar ו.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krazy Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6 well / 24 well cell culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning Incorporated</td>
<td>3506/ 3527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30mm culture plate inserts (0.4-&mu;m pore)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICM03050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>554254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>In situ cell death detection kit, TMR red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>12 156 792 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Swant</td>
<td>CB-38a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular probes)</td>
<td>A-11008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector labs</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss Stemi SV 11</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica TCS SP2 AOBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

organotypic cerebellar cultures: apoptotic challenges and detection

תרבויות Organotypic של רקמה עצבית הוצגו לראשונה בשנת 1947 על ידי הוג 1,2 ו היוו פריצת דרך בתחום מדעי המוח. מאז, הטכניקה פותחה עוד יותר, וכיום ישנם דרכים רבות להכין תרבויות organotypic. השיטה המוצגת כאן הותאמה מזו המתוארת על ידי Stoppini et al. להכנת פרוסות ומן Gogolla et al. עבור ההליך מכתים 3,4. תכונה ייחודית של הטכניקה הזו הוא שהיא מאפשרת לך ללמוד בחלקים שונים של המוח כגון ההיפוקמפוס במוח הקטן או במבנה המקורי שלהם, מתן יתרון גדול על פני תרבויות ניתק שבו כל ארגון הסלולר רשתות נוירונים הם שיבשו. במקרה של המוח הקטן זה עוד יותר יתרון משום שהוא מאפשר את המחקר בתאי פורקינג&#39;, קשה מאוד להשיג כתרבות העיקרית ניתק. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור תכונות התפתחותי מסוים של המוח הקטן במבחנה, כמו גם עבור ניסויים אלקטרו תרופתי מסוג שני בר עכברים שעברו מוטציה. השיטה המתוארת כאן נועד לחקור את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים כגון ליגנד פאס במוח הקטן המתפתח, באמצעות מכתים TUNEL למדוד מוות של תאים אפופטוטיים. אם מכתים TUNEL משולב עם סמנים סוג תא מסוים, כגון Calbindin עבור תאים פורקינג&#39;, אפשר להעריך מוות של תאים באופן תא אוכלוסייה ספציפיים. מכתים Calbindin גם משרתת את המטרה של הערכת האיכות של תרבויות cerebellar.

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection at JoVE.com

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

שיטה זו מתארת ​​את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

organotypic-cerebellar-cultures-apoptotic-challenges-and-detection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.1K Views.  The Salk Institute for Biological Studies. שיטה זו מתארת ​​את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.

Video: Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

חוקר התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה שיתוף תרבויות Organotypic גדלו על מערכים רב-אלקטרודה

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...