מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) של ארצות הברית (RO1 AI68002).

1. רקומביננטי הסארס-CoV מזוכך הכנה חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סידן זרחתי מגיב transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2X הכנה בהרוורד חיץ: מערבבים 16 גרם של NaCl, 0.4 גרם של Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, ו - 13.0 גרם של HEPES. התאם את ה-pH 7.00 ולהביא את הנפח הכולל עד 1000 מ&quot;ל במים מזוקקים. לאחר סינון הפתרון aliquot עיקור, ולאחסן אותו ב -20 ° C. רמז: כל וריאציה של ערך ה-pH תשפיע על תוצאות transfection. לפיכך, רצוי לבדוק מספר ערכים סביב 7.00 pH (לדוגמה, 6.99, 7.00, או 7.01) ו למצוא את הטוב ביותר עבור transfection בשיטת הציג להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 מ &#39;CaCl 2 הכנה: הוסף 73.5 גרם של CaCl 2 * 2H 2 O ל מים מזוקקים בנפח סופי של 200 מ&quot;ל. סנן הפתרון ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד רקומביננטי transfection וחלבון טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים 293T ב% 50-70 שעות confluency 24 לפני transfection. לגדל תאים T-175 2 ס&quot;מ רקמות צלוחיות תרבות 40 מ&quot;ל DMEM המכיל 10% חום מומת (HI) FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים כל transfection יחונכו לטמפרטורת החדר לפני transfection. ריאגנטים אלה כוללים 2X בהרוורד, 2.5M CaCl 2, DiH 2 O, ו - 6 פלסמיד rRBD. רמז: פלסמיד רקומביננטי הסופי לבנות המשמש ביטוי החלבון צריכה להכיל פפטיד האות כדי להבטיח הפרשת חלבונים רקומביננטי הביע את supernatant התרבות. תג 6x שלו ניתן להוסיף הטרמינל-C של החלבון הביע לטיהור קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן one 50 מ&quot;ל (א) ואחד 15 מ&quot;ל (ב) צינור BD פלקון, ולהוסיף ריאגנטים את צינורות כמפורט בטבלה 1. הוסף חוצץ 2X בהרוורד א &#39;צינור צינור B, להוסיף 2.5M CaCl 2 ו rRBD פלסמיד, ולהביא את עוצמת הדרישה של DiH 2 O. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> א אחת T-175 2 ס&quot;מ רקמה תרבות צפחת (4000 μL / בקבוק): להתכונן ביטוי rRBD </td></tr><tr><td colspan="2"> Tube </td><td colspan="2"> Tube B </td></tr><tr><td> 2X בהרוורד </td><td> 2000 μL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> פלסמיד דנ&quot;א rRBD </td><td> 40 מיקרוגרם </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DiH 2 O ל </td><td> 2000 μL </td></tr><tr><td colspan="4"> אחת ב 100 מ&quot;מ צלחת פטרי (1000 μL / תבשיל): להתכונן הייצור pseudovirus הסארס </td></tr><tr><td colspan="2"> Tube </td><td colspan="2"> Tube B </td></tr><tr><td> 2X בהרוורד </td><td> 500 μL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> פלסמיד דנ&quot;א הסארס CoV-S </td><td> 5 מיקרוגרם </td></tr><tr><td></td><td></td><td> HIV-1 פלסמיד (pNL4-3.luc.RE) </td><td> 5 מיקרוגרם </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DiH 2 O ל </td><td> 500 μL </td></tr></tbody></table> 1. טבלת transfection תערובת הכנה כרכים הכרכים המפורטים בטבלה 1 הן עבור יחידה אחת transfection. אם צלוחיות או יותר מנות משמשים transfection, להתאים כמויות בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון ה-DNA סידן B צינור לתוך צינור באופן dropwise, תוך שמירה מתמדת ערבוב עדין במערבולת. תנו לתערובת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות. המפתח עבור transfection סידן פוספט מוצלח תלוי בגודל ובצורה של המשקע שנוצר. לפיכך, התערובת צריכה להיות vortexed הזמן ולאט לאט בדרישה זו, וכתוצאה מכך, לשפר את היעילות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תערובת באופן dropwise ואפילו לתוך תאים 293T (4000 μL / בקבוק). התרבות התאים החממה ב 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התרבות בינוני עם בינוני טרי סרום ללא OPTI-ממ מופחתת אני סרום (50 מ&quot;ל / בקבוק) 80-10 שעות שלאחר transfection. המשך התרבות תאים עוד יומיים באותו המצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ובו הביע חלבון rRBD 72 שעות שלאחר transfection. צנטריפוגה בסל&quot;ד 6000 במשך 15 דקות כדי להסיר פסולת התא. הוסף מעכבי הפרוטאז כדי קוקטייל supernatant שנאסף ולאחסן ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לטהר חלבון רקומביננטי rRBD מ supernatant התרבות באמצעות הוראות Ni-נ.ת. ע יצרן Superflow של הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז מטוהרים באמצעות חלבון Amicon Ultra צינורות -15 הריכוז. לאחר ריכוז חלבון,להוסיף PBS על צינורות ריכוז צנטריפוגות שוב להסיר imidazole במאגר elution. חישוב ריכוז חלבון ולאחסן מטוהרים חלבון ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol></li></ol> 2. עכבר חיסון ואיסוף דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם Sigma משלים למערכת (SAS) ל 40-45 מעלות צלזיוס בהתאם להוראות היצרן. הוסף 1 מ&quot;ל PBS לכל הבקבוקון ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו חלבון משלים אמולסיה לפי הפרוטוקול בטבלה 2. פיפטה מחושב חלבון rRBD לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. מוסיפים נפח שווה של SAS adjuvant כדי הצינור מערבולת במרץ 2-3 דקות כדי ליצור אמולסיה. רמז: כרכים המפורטים בטבלה 2 מיועדים עכבר אחד. התאם כרכים על פי המספרים העכבר משמש בפועל. עבור כל קבוצה, מערבבים יחד את החלבונים ו adjuvant נדרש חיסון אחד. תמיד להכין דגימה אחת נוספת עבור החיסון כדי להבטיח דיוק. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קבוצה </td><td> 1 st חיסון (200 μL / עכבר) </td><td> 2 nd חיסון (200 μL / עכבר) </td><td> 3 rd חיסון (200 μL / עכבר) </td></tr><tr><td> rRBD חלבון </td><td> 20 מיקרוגרם חלבון PBS (100 μL) + 100 μL SAS </td><td> 10 מיקרוגרם חלבון ב PBS (100 μL) + 100 μL SAS </td><td> 10 מיקרוגרם חלבון ב PBS (100 μL) + 100 μL SAS </td></tr><tr><td> PBS מלאה </td><td> 100 μL PBS + 100 μL SAS </td><td> 100 μL PBS + 100 μL SAS </td><td> 100 μL PBS + 100 μL SAS </td></tr></tbody></table> 2. טבלה עכבר פרוטוקול חיסון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת עורי בפריים לחסן נשים BALB / c עכברים (4-6 שבועות, 5 עכברים / קבוצה), וכן להגביר פעמיים עם rRBD ו-SAS, כמצוין בטבלה 2. השתמש PBS קבוצה כמו שליטה. האתר של זריקות תת עורית נבחר בדרך כלל היא עור רפוי בין השכמות. לחלופין, הבטן הגחון הוא נפוץ, כי קל יותר להזריק, ועשוי לבחון כל דליפה מאתרי ההזרקה. כאשר מנות חוזרות של חיסונים רגילים, קל לבחור אתרים הזרקה שונים, מניעת פוטנציאל תגובות עור מקומיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bleed עכברים באמצעות רטרו מסלולית עם הרדמה לפני חיסון ו 10 ימים לאחר החיסון כל, חום סרה על 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשבית משלימים. חנות העכבר סרה ב -20 ° C עד השימוש. </li></ol> 3. נטרול איתור באמצעות נטרול Assay Pseudovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן pseudovirus הסארס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים 293T ב 100 ברקמת מ&quot;מ צלחות פטרי תרבות (2x10 6 תאים / תבשיל) 16 שעות לפני transfection, ולגדל תאים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריאגנטים transfection כמפורט בטבלה 1. Co-transfect קידוד פלסמיד-SARS CoV S חלבון קידוד פלסמיד Env-פגום, בלוציפראז-לבטא HIV-1 הגנום (pNL4-3.luc.RE) באמצעות סידן זרחתי מגיב transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עם 10 מ&quot;ל טרי DMEM המכיל 10% FBS ו -1% P / S 80-10 שעות שלאחר transfection. איסוף supernatant הסארס המכיל 72 pseudovirus שעות שלאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pseudovirus סינון דרך המסנן 0.45 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נטרול הסארס pseudovirus assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים 293T להביע הסארס-CoV קולטן ACE2 (ACE2/293T) בשעה 10 cells/100 μL 4 / 96-היטב היטב צלחות תרבית רקמה 16 שעות לפני ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל pseudovirus הסארס על ידי 2-לקפל כדי לזהות את כייל הנגיף בתאים ACE2/293T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל עכבר סרה ב 96-היטב צלחות תרבית רקמה, ולהוסיף נפח שווה של pseudovirus הסארס טיטרציה. Preincubate צלחות ב 37 ° C עבור 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להוסיף 100 μL של תערובת סרה-pseudovirus לתאי ACE2/293T, וממשיכים לגדול בתאים ב 37 ° C ב 5% CO 2. הוסף טרי DMEM 24 שעות מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר לחלוטין supernatants תרבות של הצלחות 72 שעות לאחר ההדבקה. הוסף 1X תא בלוציפראז תרבות תמוגה מגיב (60 μL / טוב), ולקדם תמוגה התא קבוע עם רעד של צלחות עבור 1-2 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא העברת lysates (50 μL / טוב) לתוך צלחות luminometer (96-Microfluor גם הצלחות). הוסף המצע בלוציפראז (50 μL / טוב) הכלולים במערכת assay בלוציפראז, וכדי לזהות פעילות בלוציפראז יחסית luminometer 384 Ultra. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב נטרול הסארס pseudovirus titer ובהווה כמו titer 50% נוגדנים מנטרלים (NT 50) 6. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+large-scale+use+of+recombinant+VP2+vaccine+for+the+prevention+of+infectious+bursal+disease+of+chickens.">Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens.</a> Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).</li><li>Tait, A., Hall, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theileria+annulata:+control+measures,+diagnosis+and+the+potential+use+of+subunit+vaccines.">Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines.</a> Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).</li><li>Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mouse,+guinea+pig+and+rabbit+models+for+evaluation+of+plague+subunit+vaccine+F1+rV270.">Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270.</a> Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+and+immunogenicity+of+SARS-CoV+S+protein+receptor-binding+domain+stably+expressed+in+CHO+cells.">Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).</li><li>Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+expressed+in+mammalian,+insect+and+E.+coli+cells+elicits+potent+neutralizing+antibody+and+protective+immunity.">Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity.</a> Virology. 393, 144-150 (2009).</li><li>Ambrosino, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+270+to+510+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+spike+protein+are+required+for+interaction+with+receptor.">Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor.</a> J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).</li><li>Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+is+a+functional+receptor+for+the+SARS+coronavirus.">Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.</a> Nature. 426, 450-454 (2003).</li><li>He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+induces+highly+potent+neutralizing+antibodies:+implication+for+developing+subunit+vaccine.">Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).</li><li>Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+high+copy+number+plasmid+into+mammalian+cells+by+calcium+phosphate+transfection.">Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection.</a> Gene. 270, 61-68 (2001).</li><li>Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+activation+and+down-regulation+by+cationic+lipid+transfection+reagents.">Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents.</a> BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Jiang, M., Deng, L., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca(2+)-phosphate+transfection+efficiency+enables+single+neuron+gene+analysis.">High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis.</a> Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).</li><li>Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+safe+neutralization+assay+for+SARS-CoV+and+characterization+of+S-glycoprotein.">Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein.</a> Virology. 326, 140-149 (2004).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

צפיפות התאים הוא גורם חשוב המשפיע על יעילות transfection פוספט מבוססי סידן. מניסיוננו, פחות מ 70% confluency התאים מביא את התוצאות הטובות ביותר. לפיכך, על מנת לשפר את יעילות transfection, מומלץ כי צפיפות התאים להישמר% סביב 50-70 של confluency. פוספט סידן שיטה transfection נחשב בדרך כלל להיות פחות יעיל בהשוואה לשיטות transfection אחרים, כגון transfection השומנים 16. עם זאת, בפרוטוקול זה, השתמשנו פוספט שונה סידן transfection שיטה לפיה קבוע ואיטי ערבוב של הפתרון transfection במערבולת מבטיח היווצרות המשקע עם גודל וצורה המתאימים, ובכך לשפר את יעילות transfection.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4*7H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S2429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2*2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C5080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HI FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10438</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OPTI-MEM I Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11836170001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Superflow</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>30450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigma adjuvant system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase assay system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase cell culture lysis reagent (5X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon Ultra - 15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC901024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microfluor 96-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra 384 luminometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for recombinant rbd-based sars vaccines: protein preparation, animal vaccination and neutralization detection

בהתבסס על פרופיל הבטיחות שלהם ואת היכולת להשפיע על המערכת החיסונית חזק נגד זיהומים, חיסונים למקטע שימשו מועמדים למגוון רחב של פתוגנים 1-3. מאז מערכת תא יונקים מסוגל שינוי שלאחר translational, ובכך ליצור חלבונים מקופלים כראוי glycosylated, חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאי יונקים הראו את הפוטנציאל הגדול ביותר לשמור antigenicity גבוהה immunogenicity 4-6. למרות שאין מקרים חדשים של סארס דווחו מאז 2004, התפרצויות בעתיד הם איום מתמיד, ולכן פיתוח של חיסון נגד מחלת הסארס-CoV היא צעד מניעתי זהיר צריך להתבצע. מזוכך של חלבון S-SARS CoV משחק תפקידים חשובים מחייב גיוס של הקולטן נוגדנים מנטרלים ספציפיים מפני הידבקות בווירוסים 7-9. לפיכך, פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות חדשניות לפיתוח חיסון מזוכך מבוססי למקטע נגד הסארס. בקצרה, חלבון רקומביננטי מזוכך (rRBD) באה לידי ביטוי supernatant התרבות של תאים 293T יונקים לקבל חלבון מקופל כראוי עם קונפורמציה נכונה immunogenicity גבוה 6. Transfection של הקידוד רקומביננטי מזוכך הפלסמיד לתאי בוצעה מכן באמצעות סידן פוספט transfection שיטה 6,10 עם שינויים מסוימים. לעומת השיטה השומנים transfection 11,12, פוספט זה שונה סידן שיטה transfection הוא זול יותר, קל יותר לטפל, ויש לו פוטנציאל להגיע ליעילות גבוהה פעם מורכבים transfection עם גודל וצורה המתאימים נוצר 13,14. לבסוף, assay נטרול הסארס pseudovirus הוצג פרוטוקול בשימוש כדי לזהות את הפעילות נטרול של סרה של העכברים שחוסנו עם חלבון rRBD. Assay זה בטוח יחסית, אינו כרוך זיהומיות הסארס-CoV, והוא יכול להתבצע ללא דרישה של biosafety-3 מעבדה 15. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש גם כדי לתכנן מחקר למקטע רקומביננטי חיסונים נגד וירוסים אחרים עם חלבונים אני בכיתה היתוך, למשל, איידס, וירוס סינסיציאלי הנשימה (RSV), נגיף אבולה, נגיף השפעת, כמו גם וירוסים Nipah ו Handra. בנוסף, שיטות להפקת pseudovirus ובהמשך להקים assay נטרול pseudovirus יכול להיות מיושם על כל אלה וירוסים.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection at JoVE.com

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

פרוטוקול זה מתאר הליך כללית לחקר קולטן מחייבים תחום רקומביננטי (RBD) מבוססי למקטע חיסונים נגד מחלת הסארס. היא כוללת שיטות transfection וביטוי של חלבונים בתאים מזוכך 293T, חיסון של עכברים עם RBD וזיהוי פעילות נטרול של העכבר סרה באמצעות נטרול הסארס הוקמה assay pseudovirus.

פרוטוקול רקומביננטי מזוכך מבוססי חיסונים הסארס: הכנת חלבון, חיסון בעלי חיים איתור נטרול

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

protocol-for-recombinant-rbd-based-sars-vaccines-protein-preparation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

42.4K Views.  New York Blood Center.  中文 

Video: Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases reported annually. The control of RABV circulation in wildlife reservoirs is typically accomplished by a strategy of oral rabies vaccination (ORV). Currently no wildlife ORV program exists in Puerto Rico. Research into oral rabies vaccines and various bait types for mongooses has been conducted with promising results. Monitoring the success of ORV relies on estimating bait uptake by target species, which typically involves evaluating a change in RABV neutralizing antibodies (RVNA) post vaccination. This strategy may be difficult to interpret in areas with an active wildlife ORV program or in areas where RABV is enzootic and background levels of RVNA are present in reservoir species. In such situations, a biomarker incorporated with the vaccine or the bait matrix may be useful. We offered 16 captive mongooses placebo ORV baits containing ethyl-iophenoxic acid (et-IPA) in concentrations of 0.4% and 1% inside the bait and 0.14% in the external bait matrix. We also offered 12 captive mongooses ORV baits containing methyl-iophenoxic acid (me-IPA) in concentrations of 0.035%, 0.07% and 0.14% in the external bait matrix. We collected a serum sample prior to bait offering and then weekly for up to eight weeks post offering. We extracted Iophenoxic acids from sera into acetonitrile and quantified using liquid chromatography/mass spectrometry. We analyzed sera for et-IPA or me-IPA by liquid chromatography-mass spectrometry. We found adequate marking ability for at least eight and four weeks for et- and me-IPA, respectively. Both IPA derivatives could be suitable for field evaluation of ORV bait uptake in mongooses. Due to the longevity of the marker in mongoose sera, care must be taken to not confound results by using the same IPA derivative during consecutive evaluations.

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

We offered captive mongooses placebo oral rabies vaccine baits with ethyl or methyl iophenoxic acid as a biomarker and verified bait uptake using a novel liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.

ניתוח של חומצה והידרוקסימית מקבילים בנמייה הודית קטנה (הרבלס) סרה לשימוש בתור חיסון בעל פה כלבת מרקר ביולוגי

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel pathogens, such as SARS-CoV-2. Multiplex serological testing can be particularly useful because it can simultaneously analyze antibodies to multiple antigens that optimizes pathogen coverage, and controls for variability in the organism and the individual host response. Here we describe a SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescent microsphere-based assay that can detect both IgM and IgG antibodies to three major SARS-CoV-2 antigens-the spike (S) protein, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD), and nucleocapsid (Nc). The assay was shown to have comparable performance to a SARS-CoV-2 reference assay for IgG in serum obtained at &#8805;21 days from symptom onset but had higher sensitivity with samples collected at &#8804;5 days from symptom onset. Further, using soluble ACE2 in a neutralization assay format, inhibition of antibody binding was demonstrated for S and RBD.

A flow analysis system for bead-based multiplexed assays which provides a two-reporter readout was used for the development of multiplex serological and antibody neutralization assays that can simultaneously measure neutralizing IgG and IgM antibodies for SARS-CoV-2.

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The increasing number of SARS-CoV-2 infections raises the need for better antibody detection assays. Current antibody detection methods compromise sensitivity for speed or are sensitive but time-consuming. A large proportion of SARS-CoV-2-neutralizing antibodies target the receptor-binding domain (RBD), one of the primary immunogenic compartments of SARS-CoV-2. We have recently designed and developed a highly sensitive, bioluminescent-tagged RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) to detect SARS-CoV-2 antibodies. The following text describes the procedure to produce the HiBiT-RBD complex and a fast assay to evaluate the presence of RBD-targeting antibodies using this tool. Due to the durability of the HiBiT-RBD protein product over a wide range of temperatures and the shorter experimental procedure that can be completed within 1 h, the protocol can be considered as a more efficient alternative to detect SARS-CoV-2 antibodies in patient serum samples.

The outlined protocol describes the procedure for producing the HiBiT-receptor-binding domain protein complex and its application for fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 antibodies.

זיהוי נוגדן דומיין מחייב קולטן SARS-CoV-2 באמצעות ביו-דו"ח מבוסס HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has been responsible for over 242 million infections and more than 4.9 million deaths worldwide. Similar to other viruses, studying SARS-CoV-2 requires the use of experimental methods to detect the presence of virus in infected cells and/or in animal models. To overcome this limitation, we generated replication-competent recombinant (r)SARS-CoV-2 that expresses bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) or fluorescent (Venus) proteins. These reporter-expressing rSARS-CoV-2 allow tracking viral infections in vitro and in vivo based on the expression of Nluc and Venus reporter genes. Here the study describes the use of rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus to detect and track SARS-CoV-2 infection in the previously described K18 human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) transgenic mouse model of infection using in vivo imaging systems (IVIS). This rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus show rSARS-CoV-2/WT-like pathogenicity and viral replication in vivo. Importantly, Nluc and Venus expression allow us to directly track viral infections in vivo and ex vivo, in infected mice. These rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus represent an excellent option to study the biology of SARS-CoV-2 in vivo, to understand viral infection and associated COVID-19 disease, and to identify effective prophylactic and/or therapeutic treatments to combat SARS-CoV-2 infection.

This protocol describes the dynamics of viral infections using luciferase- and fluorescence-expressing recombinant (r)SARS-CoV-2 and an in vivo imaging systems (IVIS) in K18 hACE2 transgenic mice to overcome the need of secondary approaches required to study SARS-CoV-2 infections in vivo.

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate antigen-displaying VLPs. Surface antigen-specific antibodies are coupled to, and thus immobilized on a solid and insoluble matrix such as beads. Due to their high affinity to the target antigen, these antibodies can capture VLPs decorated with the cognate antigen anchored in the membrane envelope of the VLPs. This protocol describes the binding of antigen-specific antibodies to protein A- or G-conjugated magnetic beads. In our study, human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs formed by the group-specific antigen (Gag) viral core precursor protein p55 Gag and displaying the envelope glycoproteins (Env) of HIV are examined. The VLPs are captured utilizing broadly neutralizing antibodies (bNAbs) directed against neutralization-sensitive epitopes in Env. The VLP capture assay outlined here represents a sensitive and easy-to-perform method to demonstrate that (i) the VLPs are decorated with the respective target antigen, (ii) the surface antigen retained its structural integrity as demonstrated by the epitope-specific binding of bNAbs used in the assay and (iii) the structural integrity of the VLPs revealed by the detection of Gag proteins in a subsequent Western blot-analysis. Consequently, the utilization of bNAbs for immunoprecipitation facilitates a prediction of whether VLP vaccines will be able to elicit a neutralizing B cell response in vaccinated humans. We anticipate that this protocol will furnish other researchers with a valuable and straightforward experimental approach to examine potential VLP-based vaccines.

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle VLP-Based Vaccines Using a Capture Assay

Here, we present a protocol to detect neutralization epitopes on antigen-displaying virus-like particles (VLPs). Immunoprecipitation of the human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs is performed using envelope glycoproteins-specific monoclonal antibodies coupled to protein G-conjugated magnetic beads. Captured VLPs are subsequently subjected to SDS-PAGE and Western blot-analysis employing viral core protein Gag-specific antibodies.

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate ...