Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) dos Estados Unidos (RO1 AI68002).

1. Recombinante SARS-CoV Preparação Protein RBD <ol><li> Prepare cálcio reagentes de transfecção de fosfato <ol><li> 2X tampão HBS preparação: Misture 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, e 13,0 g de HEPES. Ajustar o pH a 7,00 e educação de volume total para 1000 mL em água destilada. Depois de filtrar a solução para alíquota de esterilização, e armazená-lo a -20 ° C. Dica: Qualquer variação do valor de pH afetaria os resultados transfecção. Assim, é aconselhável testar vários valores de pH em torno de 7,00 (por exemplo, 6,99, 7,00, ou 7,01) e encontrar o melhor para a transfecção usando o método introduzido abaixo. </li><li> 2,5 M CaCl 2 preparação: Adicionar 73,5 g de CaCl 2 * 2H 2 O em água destilada em um volume final de 200 mL. Filtrar a solução e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Transfecção do plasmídeo recombinante e proteína de purificação <ol><li> Dividir células 293T em 50-70% 24 h antes de confluência de transfecção. Cultivar células em T-175 cm 2 frascos de cultura de tecidos em 40 mL DMEM contendo 10% inativado pelo calor (HI) FBS e 1% Penicilina / Estreptomicina (P / S) a 37 ° C em 5% CO 2. </li><li> Todos os reagentes de transfecção deve ser trazido à temperatura ambiente antes de transfecção. Estes reagentes incluem 2X HBS, 2.5M CaCl 2, Dih 2 O, e rRBD 6 plasmídeo. Dica: O plasmídeo recombinante final de construção usado para a expressão da proteína deve conter um peptídeo sinal para garantir a secreção de proteínas recombinantes expressas para o sobrenadante da cultura. A tag Sua 6x pode ser adicionado ao C-terminal da proteína expressa para a purificação fácil. </li><li> Prepare uma mL 50 (A) e um 15 mL (B) BD tubo Falcon, e adicionar os reagentes aos tubos, como indicado na Tabela 1. Adicionar 2X tampão HBS para A. tubo no tubo B, adicionar 2,5 milhões de CaCl 2 e rRBD plasmídeo, e levar o volume para a exigência da Dih 2 O. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> A. Um T-175 cm 2 frasco de cultura de tecidos (4000 mL / frasco): preparar para a expressão rRBD </td></tr><tr><td colspan="2"> Um tubo </td><td colspan="2"> Tubo B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 2000 mL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DNA plasmídeo rRBD </td><td> 40 mcg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O para </td><td> 2000 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> B. Um de 100 mm placa de Petri (1000 mL / prato): preparar-se para SARS produção pseudovirus </td></tr><tr><td colspan="2"> Um tubo </td><td colspan="2"> Tubo B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 500 mL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 50 mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DNA plasmídeo SARS-CoV S </td><td> 5 mg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> HIV-1 plasmídeo (pNL4-3.luc.RE) </td><td> 5 mg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O para </td><td> 500 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Preparação da mistura Transfection e volumes Os volumes listados na Tabela 1 são para uma unidade de transfecção. Se frascos mais ou pratos são utilizados para a transfecção, ajustar volumes em conformidade. </li><li> Adicionar a solução de DNA de cálcio no tubo B no tubo A de uma forma gota a gota, mantendo constante e suave a mistura em um vórtice. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 20-30 min. A chave para o sucesso de transfecção de fosfato de cálcio depende do tamanho e forma do precipitado formado. Assim, a mistura deve ser constantemente agitadas e, lentamente, para cumprir este requisito e, como conseqüência, melhorar a eficácia de transfecção. </li><li> Adicione a mistura de uma forma gotas e até mesmo em células 293T (4000 mL / frasco). Células de cultura em estufa a 37 ° C em 5% CO 2. </li><li> Substituir o meio de cultura com novas OPTI-MEM eu sem soro Médio Reduzido-Serum (50 mL / frasco) 8-10 h pós-transfecção. Continuar a células de cultura por mais dois dias na mesma condição. </li><li> Recolher o sobrenadante contendo proteínas expressas rRBD 72 h pós-transfecção. Centrifugar a 6000 rpm por 15 min para remover restos celulares. Adicionar coquetel inibidor de protease para o sobrenadante coletado e armazenar a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, purificar proteínas recombinantes rRBD do sobrenadante da cultura através de instruções de Ni-NTA fabricante Superflow seguinte. </li><li> Concentre-se proteína purificada usando Amicon Ultra tubos concentração -15. Após a concentração de proteína,PBS adicionar aos tubos de concentração e centrifugar novamente para remover imidazol em tampão de eluição. Calcular a concentração de proteína e armazenar proteína purificada a -80 ° C até o uso. </li></ol></li></ol> 2. Imunização mouse e Coleta de Amostra <ol><li> Pré-aquecer Sigma sistema adjuvante (SAS) para 40-45 ° C de acordo com instruções do fabricante. Adicionar 1 mL de PBS por frasco e misturar bem. </li><li> Prepare a proteína adjuvante emulsão de acordo com o protocolo na Tabela 2. Pipeta calculada proteína rRBD em um tubo de 1,5 mL. Adicionar igual volume de adjuvante SAS para o tubo e vortex vigorosamente por 2-3 min para formar emulsão. Dica: Os volumes listados na Tabela 2 são para um mouse. Ajustar volumes de acordo com os números do mouse real usado. Para cada grupo, misture as proteínas e adjuvante necessários para cada vacina. Sempre preparar uma amostra suplementar para a vacinação para garantir a precisão. <table border="1"><tbody><tr><td> Grupo </td><td> 1 ª vacina (200 mL / rato) </td><td> 2 ª vacina (200 mL / rato) </td><td> 3 ª vacina (200 mL / rato) </td></tr><tr><td> proteína rRBD </td><td> 20 g de proteína em PBS (100 mL) + 100 mL SAS </td><td> 10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS </td><td> 10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS </td></tr><tr><td> PBS controle </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Protocolo de imunização do rato </li><li> Por via subcutânea prime-imunizar fêmeas BALB / c (4-6 semanas de idade, cinco ratos / grupo), e aumentar duas vezes com rRBD e SAS, conforme indicado na Tabela 2. Use PBS grupo como o controle. O site para injeções subcutâneas geralmente escolhido é a pele solta entre as omoplatas. Alternativamente, o abdômen ventral é comumente usado, porque é mais fácil para injetar, e pode observar qualquer vazamento dos locais de injeção. Quando repetidas doses de vacinas são usadas, é fácil selecionar os locais de injeção diferentes, prevenindo potenciais reacções cutâneas locais. </li><li> Sangrar camundongos via retro-orbital com anestésico antes da imunização e 10 dias após cada vacinação, soros e calor a 56 ° C por 30 min para a inativação do complemento. Loja do mouse soros a -20 ° C até o uso. </li></ol> 3. Detecção de neutralização usando ensaio de neutralização Pseudovirus <ol><li> Prepare pseudovirus SARS <ol><li> Dividir células 293T em 100 milímetros de tecido placas de cultura de petri (2x10 6 células / prato) 16 h antes da transfecção, as células crescem e como acima. </li><li> Preparar reagentes de transfecção, conforme indicado na Tabela 1. Proteína co-transfecção um plasmídeo SARS-CoV S e um plasmídeo Env-defeituoso, luciferase expressando o genoma do HIV-1 (pNL4-3.luc.RE), utilizando reagentes de transfecção de cálcio fosfato. </li><li> Substituir médio com 10 mL fresco DMEM contendo 10% FBS e 1% P / S 10/08 h pós-transfecção. Recolher o sobrenadante contendo SARS pseudovirus 72 h pós-transfecção. </li><li> Pseudovirus filtro através de um filtro mM 0,45. Alíquotas e armazenar a -80 ° C até o uso. </li></ol></li><li> SARS ensaio de neutralização pseudovirus <ol><li> Dividir células 293T expressar SARS-CoV receptor ECA2 (ACE2/293T) a 10 4 cells/100 mL / poço em placas de 96 poços de cultura de tecido 16 h antes da infecção. </li><li> Diluir pseudovirus SARS por 2 vezes para detectar o título do vírus nas células ACE2/293T. </li><li> Serialmente diluída em soro de rato placas de 96 poços de cultura de tecidos, e adicionar igual volume de titulado pseudovirus SARS. Pré-incubação das placas a 37 ° C por 1 h. </li><li> Após a incubação, adicionar 100 mL da mistura de soros para as células-pseudovirus ACE2/293T, e continuam a crescer as células a 37 ° C em 5% CO 2. Adicionar nova DMEM 24 h mais tarde. </li><li> Remover completamente o sobrenadante da cultura de placas de 72 h pós-infecção. Adicionar 1X luciferase reagente de lise celular cultura (60 mL / poço), e promover a lise celular com constante agitação de placas por 1-2 h à temperatura ambiente. </li><li> Transferência de lisados ​​celulares (50 mL / poço) em placas luminômetro (Microfluor placas de 96 poços). Adicionar substrato luciferase (50 mL / poço), incluído no sistema de análise luciferase, e detectar a atividade luciferase relativa no luminômetro 384 Ultra. </li><li> Calcule SARS título de neutralização pseudovirus e presente como título de anticorpos neutralizantes 50% (NT 50) 6. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+large-scale+use+of+recombinant+VP2+vaccine+for+the+prevention+of+infectious+bursal+disease+of+chickens.">Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens.</a> Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).</li><li>Tait, A., Hall, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theileria+annulata:+control+measures,+diagnosis+and+the+potential+use+of+subunit+vaccines.">Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines.</a> Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).</li><li>Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mouse,+guinea+pig+and+rabbit+models+for+evaluation+of+plague+subunit+vaccine+F1+rV270.">Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270.</a> Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+and+immunogenicity+of+SARS-CoV+S+protein+receptor-binding+domain+stably+expressed+in+CHO+cells.">Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).</li><li>Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+expressed+in+mammalian,+insect+and+E.+coli+cells+elicits+potent+neutralizing+antibody+and+protective+immunity.">Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity.</a> Virology. 393, 144-150 (2009).</li><li>Ambrosino, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+270+to+510+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+spike+protein+are+required+for+interaction+with+receptor.">Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor.</a> J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).</li><li>Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+is+a+functional+receptor+for+the+SARS+coronavirus.">Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.</a> Nature. 426, 450-454 (2003).</li><li>He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+induces+highly+potent+neutralizing+antibodies:+implication+for+developing+subunit+vaccine.">Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).</li><li>Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+high+copy+number+plasmid+into+mammalian+cells+by+calcium+phosphate+transfection.">Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection.</a> Gene. 270, 61-68 (2001).</li><li>Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+activation+and+down-regulation+by+cationic+lipid+transfection+reagents.">Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents.</a> BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Jiang, M., Deng, L., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca(2+)-phosphate+transfection+efficiency+enables+single+neuron+gene+analysis.">High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis.</a> Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).</li><li>Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+safe+neutralization+assay+for+SARS-CoV+and+characterization+of+S-glycoprotein.">Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein.</a> Virology. 326, 140-149 (2004).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Densidade celular é um fator importante que afeta a eficácia de transfecção de cálcio à base de fosfato. Em nossa experiência, menos de 70% confluência das células traz os melhores resultados. Assim, a fim de melhorar a eficiência de transfecção, recomenda-se que a densidade de células ser mantidos a cerca de 50-70% de confluência. O cálcio método de transfecção de fosfato é geralmente pensado para ser menos eficiente em comparação com os métodos de transfecção outras, tais como a transfecção lipídica 16. No entanto, neste protocolo, foi utilizado um método modificado de cálcio fosfato de transfecção em que constante e lenta mistura da solução de transfecção em um vórtice garante a formação de um precipitado com o tamanho apropriado ea forma, melhorando assim a eficiência de transfecção.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4*7H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S2429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2*2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C5080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HI FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10438</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OPTI-MEM I Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11836170001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Superflow</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>30450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigma adjuvant system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase assay system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase cell culture lysis reagent (5X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon Ultra - 15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC901024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microfluor 96-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra 384 luminometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for recombinant rbd-based sars vaccines: protein preparation, animal vaccination and neutralization detection

Com base em seu perfil de segurança e capacidade de induzir potentes respostas imunes contra as infecções, as vacinas de subunidades têm sido usados ​​como candidatos para uma ampla variedade de patógenos 1-3. Desde que o sistema de células de mamíferos é capaz de modificação pós-traducional, formando proteínas adequadamente dobradas e glicosilada, proteínas recombinantes expressas em células de mamíferos têm demonstrado o maior potencial para manter elevada antigenicidade e imunogenicidade 4-6. Embora nenhum novo caso de SARS têm sido relatados desde 2004, futuros surtos são uma ameaça constante e, portanto, o desenvolvimento de vacinas contra a SARS-CoV é um passo prudente preventiva e deve ser realizada. O RBD de proteína SARS-CoV S desempenha um papel importante na ligação do receptor e indução de anticorpos neutralizantes específicos contra a infecção pelo vírus 7-9. Portanto, neste protocolo, descrevemos novos métodos para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade RBD baseada contra SARS. Resumidamente, a proteína recombinante RBD (rRBD) foi expressa em sobrenadante de cultura de células de mamíferos 293T para obter uma proteína dobrado corretamente com conformação adequada e elevada imunogenicidade 6. A transfecção do plasmídeo recombinante codificação RBD às células foi então realizada usando um método de transfecção de fosfato de cálcio 6,10 com algumas modificações. Comparado com o método de transfecção lipídica 11,12, este método modificado de cálcio fosfato de transfecção é mais barato, mais fácil de manusear, e tem o potencial para alcançar alta eficácia, uma vez um complexo de transfecção com o tamanho e forma adequadas é formado 13,14. Finalmente, um ensaio de neutralização pseudovirus SARS foi introduzida no protocolo e usado para detectar a atividade neutralizante de soros de camundongos vacinados com a proteína rRBD. Este ensaio é relativamente seguro, não envolve um infecciosas SARS-CoV, e pode ser realizada sem a exigência de um laboratório de biossegurança-3 15. O protocolo aqui descrito também pode ser usado para desenhar e estudar vacinas subunidade recombinante contra outros vírus com proteínas de classe I de fusão, por exemplo, HIV, vírus sincicial respiratório (VSR), o vírus Ebola, o vírus influenza, bem como Nipah e Handra. Além disso, os métodos para gerar um pseudovirus e, posteriormente, estabelecer um ensaio de neutralização pseudovirus pode ser aplicada a todos estes vírus.

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Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Este protocolo descreve um procedimento geral para o estudo de ligação aos receptores recombinantes de domínio (RBD) com base em vacinas de subunidade contra a SARS. Ele inclui métodos para transfecção e expressão da proteína em células RBD 293T, a imunização de camundongos com RBD e detecção de atividade de neutralização dos soros do mouse usando um ensaio de neutralização estabelecida SARS pseudovirus.

Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

protocol-for-recombinant-rbd-based-sars-vaccines-protein-preparation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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