פיתוח של שיטת האיחוד-ELISA נתמכה על ידי NIH מענק RO1AG023687.

1. תא היונקים תרבות האיחוד-ELISA יכול להתבצע על כל סוג תא יונקים כי ניתן לגדל בתרבית. אנחנו מעדיפים להכין בינוני קבוצות גדולות של תאים כך nucleosomes ניתן לבודד בכמות מספקת כדי להכין כמה צלחות עמוסות זהה ELISA, ובכך מאפשר מבחני עם נוגדנים שונים (ABS). קשקשים תרבות הבאים מספקים חומר למכביר: עבור תאים עכבר embyronic גזע, לגדל אחד או שניים 15 ס&quot;מ צלחות של תאים תאים ללא מזין. עבור fibroblasts, לגדול 5-10 צלחות 15 ס&quot;מ עד מפגש. 2. בידוד של גרעינים הערה: כל הצעדים הם על הקרח עם טרום צונן מאגרים, למעט כפי שצוין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים עם טריפסין 3 מ&quot;ל לכל צלחת, לשלב, ולהוסיף 20 מ&quot;ל קר כקרח PBS / בוטיראט. צנטריפוגה בסל&quot;ד 1000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 10 מ&quot;ל PBS / בוטיראט ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 1000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend במאגר 4 מ&quot;ל תמוגה עם מעכבי פרוטאז (סיגמא אולדריץ P-8340). Dounce homogenize 20 משיכות עם העלי מסוג B על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 2000g במשך 10 דקות ב 4 ° C. (Supernatant מכיל הציטופלסמה, אשר אינו נחוץ עבור פרוטוקול זה, אך ניתן לשמור לשימושים אחרים במקרה הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 2 מ&quot;ל קרים כקרח לשטוף חיץ C (עם מעכבי פרוטאז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת חומר resuspended על כרית 5 מ&quot;ל סוכרוז 30%, אז צנטריפוגות ב 2400g במשך 5 דקות בתוך הרוטור דלי מתנדנד. גרעינים יעברו דרך כרית, ופסולת נשאר על הממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל נפח הנוזל בזהירות resuspend את הגרעינים ב 250 μl חיץ קרים לשטוף C + מעכבי פרוטאז. </li></ol> 3. בידוד של nucleosomes ידי באתרו עיכול Micrococcal (MNase) nuclease אנו משתמשים בהליך שבו הכרומטין מתעכל באתרו בתוך גרעיני על ידי יציקת להם MNase, ואחריו טיפול hypotonic לנהוג nucleosomes שלם חופשי לתוך supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl 0.1 M CaCl 2 המדגם. שים בבלוק 37 חום מעלות צלזיוס. אפשר להניח 37 ° C הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 יחידות MNase (Micrococcal nuclease, סיגמא אולדריץ, מומס ב 2 units/10μl במאגר MNase), ואז דגירה למשך 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות, עם ערבוב תדיר באמצעות קצה pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 μl של ה-pH M Na-EDTA, 0.5 8.0 להפסיק את התגובה. שימי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 2000g 4 דקות, להשליך supernatant. Resuspend גלולה ב 300 מ&quot;מ 0.2 μl Na-EDTA. חנות על קרח h 1 עם pipeting עדין מדי פעם. (אלה התנאים hypotonic לשחרר nucleosomes ללא גרעינים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 3000 גרם 4 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant, אשר מכיל nucleosomes חופשי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שוב את הכדור עם 300 מ&quot;מ 0.2 μl Na-EDTA. חנות על קרח h 1 עם pipeting עדין מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 3000g עבור 4min ב 4 ° C. לשמור על supernatant ולשלב עם supernatant הראשון של שלב 5. ההכנות mononucleosome וכתוצאה מכך ניתן aliquoted ומאוחסנים ב -80 ° C. </li></ol> הערה: כמות הכרומטין ניתן ונרשמת בגסות על ידי מדידת ספיגת ב 260 ננומטר של המדגם 10 μl הוסיף μl 990 מים. 260 = 10 (לאחר התאמה דילול 1 / 100) מתאים על 1mg/ml של הכרומטין. כמו כן, במהלך ההליך הנ&quot;ל, דגימות קטנות עשויה להישמר ונותחו לאחר מכן עבור תוכן ה-DNA שלהם כדי לפקח על איכות והיקף digestions MNase, אשר אמור להכיל בעיקר ה-DNA של 146 נ&quot;ב אורך. Laddering מעיד על העיכול MNase שלם. הערה: תמונה 1 מכיל סיכום ניתח של בידוד גרעיני digestions צעדים MNase. 4. הנוקלאוזום-ELISA (האיחוד-ELISA) אנו מזהים PTMs על שברים המכיל nuclesosomes שלם יליד שהיו משותקים על 96 גם צלחות ELISA microtiter. עבור כל דגימה, אנחנו עושים סדרה של פי 2 דילולים, ואלה מצופים על בארות בשלושה עותקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל MaxiSorp צלחות לילה בשעה 4 ° C עם 50 μl / היטב nucleosomes מדולל חיץ ציפוי. הצעות דילולים כפולה הסידורי של nucleosomes מוכנים מן השורה העליונה אל השורה התחתונה על ידי הוספת 0.1 מיקרוגרם, 0.05 מיקרוגרם, 0.025 מיקרוגרם, 0.0125 מיקרוגרם, 0.00625 מיקרוגרם, 0.00313 מיקרוגרם, 0.00156 מיקרוגרם, עם חיץ ציפוי בלבד (0 הכרומטין מיקרוגרם) בתחתית שורה. (הערה: מכסה צלחת יש צורך בשלב זה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, לשטוף את הצלחות 4 פעמים עם 200% μl / PBS/0.5 גם Tween-20 בטמפרטורת החדר (RT) עבור סכום משולב של 10 דקות עם מכונת כביסה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק 1 שעות ב RT עם BSA 100 μl / גם Tween-20 / 5% PBS/0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ חסימת ידי ניעור צלחת הפוכה במרץמעל לכיור. מכסים ומאחסנים את הצלחות ב -20 ° C, או לעבור ישירות לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 ° Abs בנפח של 50 μl / מדולל היטב 1:1000 (או לפי הצורך) ב% PBS/0.05 Tween-20 / 5% BSA, דגירה על RT במשך שעה 1 על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות 4 פעמים עם 200% μl / PBS/0.5 גם Tween-20 ב RT עבור סך כולל של 10 דקות בתוך מכונת כביסה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף צנון סוס peroxidase (HRP), מצומדות 2 ° ABS, בדילול 1:5000 (או לפי הצורך) ב% PBS/0.05 Tween-20 / 5% BSA ב RT במשך שעה על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות 4 פעמים עם 200% μl / PBS/0.5 גם Tween-20. לשטוף כל ב RT ו - עבור סכום כולל של 10 דקות עם מכונת כביסה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הצלחות על ידי הוספת 50 μl של המצע TMB היטב כל 10 דקות ב RT. עצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl / גם של 2N H 2 SO 4 ולקרוא את צלחות 450 ננומטר. (טיפ: צנטריפוגה בסל&quot;ד 1500 דקות 2 באמצעות צלחת הרוטור כדי לפרוק כל בועות האוויר בארות לפני absorbances קריאה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא קריאות לקבצים גיליון אלקטרוני עבור ניתוחים סטטיסטיים כמותיים. </li></ol> ריאגנטים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> PBS / בוטיראט </td></tr><tr><td> 135 mM NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 מ&quot;מ KCl </td></tr><tr><td> 8 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;מ KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-בוטיראט </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תמוגה הצפת </td></tr><tr><td> 250 מ&quot;מ סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM טריס-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-בוטיראט </td></tr><tr><td> 4 מ&quot;מ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0.1% Triton X-100 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לשטוף חיץ C </td></tr><tr><td> 250 מ&quot;מ סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM טריס-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-בוטיראט </td></tr><tr><td> 4 מ&quot;מ MgCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סוכרוז כריות </td></tr><tr><td> 30% (w / v) סוכרוז בכביסה חיץ C </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Microccocal nuclease הצפת </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ נפו 4 חוצץ, pH 7.0 </td></tr><tr><td> 0.025 mM CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ציפוי חיץ </td></tr><tr><td> הפתרון 80ml + 170ml פתרון B + 250 מ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> הפתרון: 0.2 M Na 2 CO 3 </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39;: 0.2 מ&#39; NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. נציג תוצאות שימוש בשיטת האיחוד-ELISA, סדרה של הצלחות מספר זהה מוכנים אשר ניתן עמוסה הכרומטין מוכן בצורה של mononucleosomes. אנחנו בדרך כלל מכינים סדרה של צלחות זהה טעון, כך שכל יכול להיות נחקר עם אנטי PTM נוגדנים ספציפיים שונים (ABS). אנחנו גם תמיד להכין צלחת שיכול להיות נחקר עם Ab המאתר ההיסטונים מבלי להתייחס למצב שינוי שלהם לשלוט טעינת מסך הכרומטין. בקרה זו חיונית כדי להשוות מאוחר יותר כמותית תוכן PTM של nucleosomes שהוכן מדגמים שונים. כדי לכמת את רמות PTMs בתוך מדגם הכרומטין נתן לנו לתקן את ערכי ספיגת גלם שימוש בגישה זו: ראשית, אנו לחסר כל אות רקע שימוש בערכים המתקבלים בארות מלאה המכילה לא הכרומטין (רקע זניח בדרך כלל). לאחר מכן, אנו לתקנן PTM ספציפי אותות NU-ELISA לתוצאות שהתקבלו צלחת עמוסה זהה היה assayed עם Ab המאתר nucleosomes תלוי במצב שינוי שלהם. (השתמשנו Abs polyclonal ספציפיות ההיסטונים H2A או H2B למטרה זו). לאחר מכן, אנו לקבוע אמצעים סטיות עבור כל דילול של הכרומטין, ולהשתמש בנתונים המתקבלים החלק הליניארי של assay ELISA. דוגמאות מפורטות של האיחוד-ELISA ניתוחים מתמטיים וסטטיסטיים דווחו בעבר 4 <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Diagam סכמטי של האיחוד-ELISA צעדים. תאים א היונקים נקצרים; גרעינים ב מופרדים על ידי תאים Dounce homogenization, שיבשו ג תאים נטענים על גבי כרית w / v 30% סוכרוז, ד לאחר צנטריפוגה, גרעינים מופקדים גלולה, E, F. הכרומטין מתעכלים באתרו בעיקר על ידי mononucleomes MNase, G, H , אני. mononucleosomes מסיסים מופקים על ידי טיפול hypotonic ו צנטריפוגה חוזרות ונשנות של שאריות חומר גרעיני. Mononucleosomes ג&#39;מ מדגמים שונים (שכותרתו samp. 1 ו -2 במקרה זה) הם מצופים על microtiter בארות סדרת זהה טעון צלחות ונחקרו עם PTM ספציפי ABS ו-PTM Abs עצמאית כדי לקבוע טעינת הכרומטין מוחלט. תיאור של האות ק &#39;ההפרש רמות גילוי שני מדגמים שונים בתוכן PTM שלהם, עדיין יש הכרומטין הכוללת תוכן דומה, לשפוט לפי immunoreactivity אנטי H2B.

<ol>
	<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li><li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code.">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li><li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells.">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li><li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture.">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li><li>Thomas, J. O., Gould, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+fractionation+of+chromatin+and+linker+histones.">Isolation and fractionation of chromatin and linker histones.</a> Chromatin: a practical approach. , 12-14 (1998).</li><li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Gould, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+core+histones+and+non-histone+chromosomal+proteins.">Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins.</a> Chromatin: a practical approach. , 38-39 (1998).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

האיחוד-ELISA מספק שיטה לברר את מצב גלובלית של PTMs הנוקלאוזום להציג בתוך סוג תא מסוים. האיחוד-ELISA מחקרים הראו כי שינוי גלובלי מדינות הנוקלאוזום שונים השוואות של סוגי תאים מסתעף 4. בנוסף, האיחוד-ELISA פרופילים PTM להשתנות כאשר התאים נחשפים סוכני modulatory epigenetic כגון trichostatin-A, או כאשר עכבר לתאי גזע embyronic הבדיל 4. השיטה גם יושמו בהצלחה ללמוד את הכרומטין בתאי גזע עובריים אנושיים 5. חשוב לציין את האיחוד-ELISA, במתכונתו הנוכחית, יכול לזהות רק את החתימה המשולב של PTMs להציג בתוך לסך של epigenome הסלולר. זה שונה במידה ניכרת מן immunoprecipitation הכרומטין הגנום כולו, אשר יכול לקבוע את חלוקת PTM מסוים על פני לוקוסים גנטיות ספציפיות. הצעדים הראשונים של נהלי האיחוד-ELISA מותאמים מן השיטות הקודמות לבודד mononucleosomes מן הגרעינים יונקים 6,7. שיטות אלה מותאמים מספקים דרך אמצעי כדי להשיג איכות גבוהה mononucleosomes שלם מתאי יונקים, ואת השברים וכתוצאה מכך הם מקיפים תוכן הכרומטין שלהם, אבל מכילים הרבה חומרים גרעיניים נוספים. מאז Abs ספציפיים משמשות, מזהמים שאינם nucleosomal חומר נסבל היטב assay NU-ELISA, בניגוד המוני spec גישות הדורשות טוהר יותר. עם זאת, האיחוד-ELISA רגיש יותר מאשר כמותיים המערבי סופג 4, ובכך לספק חלופות טובות מערבונים ו spec המונית לגילוי PTMs nucleosomal.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Micrococcal Nucleae </td><td> סיגמא </td><td> N3755 </td><td> הפוך את aliquots של חיץ 2 U/10μl, המאוחסן ב -20 ° C </td></tr><tr><td> Nunc MaxiSorp microtiter פלטות </td><td> דיג </td><td> 12-565-135 </td><td> מכסה צלחת דבק ניתן גם להזמין דרך פישר </td></tr><tr><td> פלייט אוטומטית מכונת כביסה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> שלב 1-TMB-ELISA המצע </td><td> לנקב </td><td> 34028 </td><td> חנות ב 4 ° C טרום חם RT לפני השימוש או כמצוין בגיליון מפרט </td></tr><tr><td> Microtiter פלייט Reader </td><td> Bio-Rad microplate הקורא (דגם: 680) </td><td></td><td> רוב colorimetric הקורא מודלים צלחת מתאימים </td></tr></tbody></table>

detection of post-translational modifications on native intact nucleosomes by elisa

הגנום של אאוקריוטים קיימת כמו הכרומטין המכיל גם דנ&quot;א וחלבונים. היחידה הבסיסית של הכרומטין הוא הנוקלאוזום, אשר מכיל 146 זוגות בסיסים של DNA הקשורים עם שני כל אחד ההיסטונים H2A, H2B, H3, H4 ו 1. N-מסוף הזנבות של ההיסטונים עשירים ליזין ארגינין משתנים שלאחר transcriptionally ידי acetylation, מתילציה, ועוד פוסט translational שינויים (PTMs). תצורת PTM של nucleosomes יכולים להשפיע על פעילות תעתיק של DNA הקשורים, ובכך לספק מצב של ויסות הגנים כי הוא epigenetic בטבע 2,3. פיתחנו שיטה הנקראת הנוקלאוזום ELISA (האיחוד-ELISA) כדי לקבוע כמותית חתימות PTM גלובלית של nucleosomes שחולצו מן התאים. האיחוד-ELISA רגיש יותר מאשר כמותיים המערבי סופג, והוא שימושי לחקור את המדינה epiproteomic של סוגי תאים ספציפיים. מאמר זה מציג את יומן הווידאו נהלים מפורטים לביצוע האיחוד, ELISA וניתוח.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA at JoVE.com

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

הנוקלאוזום ELISA (האיחוד-ELISA) היא שיטה רגישה כמותי כדי לזהות דפוסים גלובליים של הפוסט translational שינויים בהכנות של nucleosomes יליד כנן. שינויים אלה כוללים methylations, acetylations ו phosphorylations על היסטון שאריות חומצת אמינו ספציפית, ולכן האיחוד-ELISA מספק assay proteomic העולמי של המדינות הכולל הכרומטין שינוי של סוגי תאים ספציפיים.

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

detection-post-translational-modifications-on-native-intact

Research

JoVE Journal

Biology

17.2K Views.  Stanford University. הנוקלאוזום ELISA (האיחוד-ELISA) היא שיטה רגישה כמותי כדי לזהות דפוסים גלובליים של הפוסט translational שינויים בהכנות של nucleosomes יליד כנן. שינויים אלה כוללים methylations, acetylations ו phosphorylations על היסטון שאריות חומצת אמינו ספציפית, ולכן האיחוד-ELISA מספק assay proteomic העולמי של המדינות הכולל ה...

Video: Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

השוואת שיטות להסרת Cell חלבון מארח טבק ידי לבנת צמחים שלמים או על ידי טיפול בחום של תמציות

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...