בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

בהתחשב במורכבות של התגובות בכל מקום ו deubiquitination בתוך התאים חשוב להקים במבחנה assays עם רכיבים מטוהרים מוגדרים. זה עוזר להבין את המנגנונים של בכל מקום ודוביקינציה וגם לקבוע כיצד מוטציות הקשורות לגנים המקודדים את האנזימים האחראים לתגובה זו יכולות לגרום למחלות אנושיות. אנו יכולים לזהות את התחומים ואת המוטיבים ברכיבים אלה המניעים תגובות אלה.

אנחנו יכולים גם לפתח מסיונות מסך תפוקה גבוהה שניתן להשתמש בהם כדי לסנן עבור מעכבי מולקולה קטנה שניתן לפתח כטיפולים פוטנציאליים. כדי להתחיל תזה חיידקים, להוסיף קוקטייל PMSF ו antiprotease לתוך חיץ תרסיס קר קרח A.Add 25 מיליליטר של מאגר תזה A לתוך הבקבוק המכיל גלולת חיידקים ולתלות מחדש את גלולה. מעבירים את ליט המכיל חיידקים בצינור עבור sonication.

השתמש sonicator בדיקה כדי sonicate lysate ב 70% משרעת פלט במשך 30 שניות, ארבע עד חמש פעמים. ואז צנטריפוגה ב 21, 000 פעמים g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של החיידקים lysate עם קדרים GSH במשך חמש שעות על פי כתב היד, להעביר את חרוזים יחד עם 10 מיליליטר של חיץ לתוך עמוד כרומטוגרפיה ריקה.

לאחר מכן, להוסיף 1.5 מיליליטר של חיץ A המכיל גלוטתיון 25 מילימולרית לתוך העמוד ולאסוף את האלוטיון על ידי כוח הכבידה לתוך 1.5 microtubes מיליליטר. חזור על הליך האלוטיון ארבע פעמים עם חיץ טרי A המשך טיפול של שברים אלוט על פי כתב היד. כדי להתחיל, תן שימוש חוזר כדורי חיידקים His-BAP1 ו- MBP-DEUBAD ב 25 מיליליטר של חיץ תזה קרה קרח B.Mix 25 מיליליטר של כל ליסאט ודגירה על קרח במשך 15 דקות.

Sonicate ולאחר מכן צנטריפוגה lysate ב 21, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות. לאחר צנטריפוגה lysate, לסנן את lysate דרך מסנן מזרק נקבובית 0.45 מיקרומטר לתוך בקבוק ומערבבים אותו עם חמוזי ניקל NTA. דגירה בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות במשך חמש שעות.

לאחר מכן, לסובב את חרוזים ב 25, 000 פעמים g במשך שלוש דקות. השתמש פיפטה כדי להציל את supernatant בצינור 50 מיליליטר כמו הזרימה דרך. לשטוף את חרוזים עם חמישה מיליליטר של חיץ B, המכיל 20 imidazole מילימולאר, שש פעמים עם שלוש דקות צנטריפוגה.

לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את חרוזים עם 10 מיליליטר של חיץ B לתוך עמוד כרומטוגרפיה ריקה ולהוסיף מיליליטר אחד של חיץ B המכיל 200 מילימולרים imidazole. לאסוף את האלוטיון על ידי כוח הכבידה לתוך 1.5 microtubes מיליליטר המכיל DTT ו EDTA. חזור על הליך האלוטיון ארבע פעמים ובריכה שברים אלוט הרצוי לתוך צינור 15 מיליליטר.

הוסף מאגר C כדי לדלל את המתחם האלותי שלוש פעמים. לאחר מכן מעבירים את האלוטיון המדולל אל גם בצינורות ומדגרים במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ברעידות. בבוקר, צנטריפוגה הצינורות ב 2, 500 פעמים גרם במשך שלוש דקות ולשמור את supernatant בצינור 15 מיליליטר כמו לזרום דרך.

לשטוף את חמוזי חלבון כרוך עם חמישה מיליליטר של חיץ C במשך חמש עד שש פעמים. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מאגר D למתחם המטוהר His-BAP1/MBP-DEUBAD על גם 50%. העבר 20 מיקרוליטרים של פתרון 50%חרוזים לצינור מיקרוצנטריפוגה והוסף 20 מיקרוליטרים של מאגר מדגם לאמלי פעמיים לניתוח SDS-PAGE וכחול קומאסי.

אחסן את פתרון חרוזים הנותרים במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לאחר תרבות תאי HEK293T, צלחת 12 מיליון תאים ב 20 מיליליטר של מדיה מלאה בצלחת תרבות 15 ס"מ, יום אחד לפני transfection. אחרי יום אחד, מתחת למכסה המנוע של תרבות התאים, שאף מדיה ואספקה עם 12 מיליליטר של מדיה חופשית בסרום.

לתפור את התאים עם 21 מיקרוגרם של pCDNA שטוח-H2A באמצעות 63 microliters של PEI במיליגרם אחד למיליליטר. לאחר 12 שעות, יש לשנות למדיום מלא. לאחר קצירת התאים על פי כתב היד, להשתמש מחדש את גלולת התא בכ -10 כרכים של חיץ E המכיל NEM כדי לעכב deubiquitinases ואתה דגירה על קרח במשך 20 דקות.

לאחר צנטריפוגה ב 3, 000 פעמים g במשך חמש דקות, להשליך את העל טבעי. לשטוף את גלולת הכרומטין פעמיים עם 10 כרכים של חיץ E הראשון ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם חיץ F.Resuspend הכרומטין בחמישה מיליליטר של חיץ F ולטפל גלולה עם גרעין מיקרוקוקל בריכוז של שלוש יחידות למיליליטר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, להעביר aliquot 40 microliter של התערובת לצינור 1.5 מיליליטר לניתוח של שברי DNA נוקליוזומלי.

הוסף 40 מיקרוליטרים של פנול-כלורופורם ו-20 מיקרוליטרים של מאגר טעינת דנ"א פי שש. מערבולת ולסובב ב 18, 000 פעמים g במשך שתי דקות. לאחר מכן להעביר 15 microliters של השלב הממימי בג'ל 2%agarose לטעון את ה-DNA.

לאחר עצירת התגובה והצנטריפוגה על פי כתב היד, הדגירה את שבר הכרומטין המסיס עם קדילי שדון נגד דגל בצינור 15 מיליליטר לילה בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות. לשטוף את חרוזים שש פעמים עם חיץ G.Transfer את חרוזים עם חמישה מיליליטר של חיץ G לתוך עמוד כרומטוגרפיה ריקה. לדלל את הנוקלאוזומים הקשורים של חרוז עם 260 microliters של חיץ G המכיל 200 מיקרוגרם למיליליטר של פפטיד אלוטיון דגל ואחד עד חמישה אחד טוחן Tris ב pH שמונה.

תחשוף את הנוקלאוזומים שלוש פעמים, שעה אחת בחדר הקר. כדי לבצע בדיקה בכל מקום, ראשית להוסיף מיקרוגרם אחד של נוקלאוזומים מטוהרים ב 40 microliters של חיץ H.After, להוסיף תערובת פתרון אנזים המכיל 250 ננוגרם של UBE1, 672 ננוגרם של UB ו E2 UB אנזימים באוב ומיקרוגרם אחד של BMI1-RING1B E3 תרכובת רצועות ubiquitin לתוך הצינור. הדגירה את התגובה במשך שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מדי פעם.

לעצור את התגובה על ידי הוספת 40 microliters של שני פעמים Laemmli מדגם Buffer ולנתח histone H2AK119 בכל מקום על ידי כתמים מערביים. כדי לבצע את בדיקת הדאוביקינטיה במבחנה, יש להשתמש מחדש בגרעין המטוהר ב-40 מיקרוליטרים של חיץ I ומיקרוגרם אחד של חיידקים מטוהרים חנוזי His-BAP1/MBP-DEUBAD. מניחים את הצינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות כדי לבצע את תגובת deubiquitination עם רעידות מדי פעם.

ואז לעצור את התגובה על ידי הוספת 40 microliters של מאגר Laemmli פעמיים לנתח על ידי immunoblotting. בניסוי זה, כתמים כחולים קומאסי לטיהור טיפוסי של תסביך GST-BM1-RING1B באמצעות חסידי זיקה GST, מראה כי הלהקות נודדות במשקל טוחנת צפוי סביב 45 קילודאלטון ו 13 קילודלטון בהתאמה. באופן דומה הטיהור של מתחם MBP-DEUBAD His-BAP1 הביא גם להכנות הומוגניות גבוהות יחסית עם להקות סביב 90 קילודאלטון ו -55 קילודאלטון בהתאמה.

מצד שני השבר הגרעיני המטוהר מורכב למעשה על ידי רצועת זוג בסיס 147 המציין את נוכחותו של שבר מונונוקלוזומלי מועשר מאוד. כתמים כחולים קומאסיים של נוקלאוזומים מטוהרים מראים תבנית רצועה טיפוסית של ארבע תת-יוניות היסטון עם כמויות סטואיכומטריות. בכל מקום של histone H2A עם קומפלקס BMI1-RING1B מראה עלייה תלוית זמן של הצורה בכל מקום של החלבון בעוד רמות הטופס ללא שונה הם ירדו בו זמנית.

התגובה בכל מקום היא הכוללת כמו כמעט כל החלבונים H2A הופכים H2A K119ub. מצד שני, בדיקה deubiquitination נערך נוקלאוזומים מקומיים. בעקבות הדגירה של נוקלאוזומים אלה עם BAP1-DEUBAD נצפתה הפחתה תלוית זמן של אות H2A K119ub.

ההצלחה של תגובות בכל מקום ו deubiquitination תלויים באופן החלבון מטוהרים. אנו זקוקים לתפוקה טובה והשימוש במאגר עבור שימוש חוזר בחלבון וטיהור צריך להיות תואם לתגובות ביוכימיות. כאשר בדיקה זו בכל מקום ו deubiquitination מבוססים היטב אנו יכולים לבדוק את מפעילי ומעכבים להשפיע, כמו גם את ההשפעה של מוטציות גנים הקשורים למחלות.

שיטה זו הוקמה על ידי תרומתן של מספר מעבדות והן שימושיות מאוד להבנת המנגנונים של בכל מקום ודוביקינציה. כמה כימיקלים מסוכנים וצריך לתמרן אותם בשכונה. זה כולל פנול-כלורופורם, חומצות, בסיסים, והפחתת סוכנים.