אנו מודים לחברי מעבדה משורר, במיוחד שי מלצר, עדי Alajem, Edupuganti ראגו רם, באדי סרי Sailaja, אנה Mattout ואלווה בירן, הערות ביקורתיות עבור בעיות הירי ניסויים photobleaching על בסיס יומי. EM מהווה ח ר &#39;יוסף בל בראון מרצה בכיר למדעי החיים והוא נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (ISF 943/09), את משרד הבריאות (6007) האיחוד האירופי (IRG-206872 ו 238176), למלחמה בסרטן Research Foundation, מענקים פנימי רפואי יישומי של האוניברסיטה עברית ואת הפסיכו המכון הישראלי.

1. ציפוי תאים ES ט = 0 שעות MEF ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמל ההדמיה לחיות טוב 8-μ-שקופיות (ibidi: מינכן, גרמניה) עם ג&#39;לטין או בכוסות החדרים לכסות (Lab-Tek, רוצ&#39;סטר, ניו יורק) או זכוכית התחתונה מנות התרבות (MatTek: אשלנד, MA). השאירו דקות 5-30 ו לשאוב משם את הג&#39;לטין חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 22,000 MEFs / גם בנפח 250 סך μl של DMEM [בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS)]. אפשר לתאים לגדול בתרבית רקמה אינקובטור (37 ° C, CO2 5%). </li></ol> ט = 6 שעות ES ציפוי התא <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed כל MEF מצופה היטב / טוב בנפח 250 סך μl של התקשורת ES תא עם 15,000 תאים R1 [בתוספת סרום ESC כיתה 10% שור העובר (FBS), נתרן pyruvate 1 מ&quot;מ, 0.1 mM חומצות אמינו חיוניות, β 0.1 מ&quot;מ mercaptoethanol, 1000 ו - U / ml גורם ללוקמיה מעכבות (LIF)], כדי להשיג 30% עד 50% מפגש למחרת. </li></ol> 2. Transfecting תאים ES T = 24 שעות חלוף transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את תא התקשורת ES עם 250 μl / גם של מדיה תא טרי ES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.5-ml בדיקה סטרילית, להוסיף 100 μl בסרום חינם התקשורת [Opti-ממ (Gibco)], ולאחר מכן להוסיף 10 Transit-LT1 μl מגיב transfection (Mirus) ישירות לתוך התקשורת החופשית בסרום. מערבבים על ידי pipetting עדין דגירה בטמפרטורת החדר למשך 50-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף GFP 1.5 מיקרוגרם היתוך DNA פלסמיד (H1e, H1o או HP1) אל מעבר בדילול-LT1 מגיב. מערבבים על ידי pipetting עדין דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 13.5 / היטב לתערובת transfection. מערבולת 8-μ-שקופיות היטב על מנת להבטיח פיזור אפילו. אחרי 24 שעות להחליף את תא התקשורת הישנה ES עם 250 μl של התקשורת תא טרי ES. </li></ol> 3. ביצוע FRAP ו FLIP ט = 48-72 שעות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניסוי יכול להתבצע על כל confocal מיקרוסקופ סורק לייזר (CLSM) אבל מאז בניסוי FRAP / FLIP נורמלי, תמונות רצופות רבים נרכשים, מומלץ להשתמש במיקרוסקופ ספינינג דיסק confocal, המאפשרת מהירות הרכישה מבטיחה כי לא מדגם לא רצויים הלבנת תתרחש לאחר האירוע הראשוני הלבנת מכוונת. כאן, אנו ממליצים להשתמש המהפכה ספינינג מערכת דיסק confocal (www.Andor.com), עם ראש המז&quot;פ-X דיסק ספינינג Yokogawa. מערכת זו יש את היכולת כפול photobleach באמצעות מודול מיוחד FRAPPA עם מערכת סריקה נקודה, כדי לעבור במהירות את האור כדי לאסוף את התמונות באמצעות דיסק מסתובב. 3 חלבונים fluorescing הנפוץ ביותר המשמש photobleaching ניסויים GFP, YFP ושרי. אם ה-GFP או YFP משמשים, ~ 488 ננומטר לייזר נדרשת. עבור שרי, שימוש בלייזר ~ 560 ננומטר. בכל מקרה, אנו ממליצים להשתמש לייזרים של מצב מוצק. לאחר שלב אוטומטית שימושי אבל לא חובה. מאז תאים חיים הם צילמו, חיוני להשתמש קאמרית סביבתיים (אנו משתמשים אחד מן LIS, שוויץ), שליטה חמצן, לחות, טמפרטורה ו-CO 2. FRAP מבוצע באמצעות לייזר בעוצמה מקסימלית תוך ההדמיה נעשית עם כוח לייזר המינימלי הנדרש (בדרך כלל באזור של 10%, כאשר רמת הקרינה היא נאותה). שים את התאים עם אור ניאון של אורך הגל המתאים ובחרו תא להביע GFP באמצעות עדשה 60x טבילה שמן. להבטיח חלוקה subcellular הנכון. מדי פעם, כאשר רמות ביטוי גבוהות מדי, לוקליזציה של החלבון עשוי &quot;לשפוך&quot; אל תאים אחרים כגון nucleolus. תאים כאלה לא צריכים להיות נבחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להגדיר פרוטוקול הדמיה: אוספים 3-5 מסגרות לפני photobleaching, אז photobleach ב euchromatin או heterochromatin (כפי שנצפו מרוכז GFP מוקדים) ולאסוף 90-120 מסגרות לאחר photobleach, עם מרווחי 250-1000 ms: H1e-GFP, 1000 ms, H1o HP1 ו-GFP, 250 ms (מרווח הזמן משתנה על פי הדינמיקה חלבון, שבו חלבונים דינמי מאוד לדרוש מרווח זמן קצר יותר). בדרך כלל אנחנו משתמשים עוצמת הלייזר 8-10% עבור photobleaching עם דופק לייזר של μseconds 20-40 (1-2 חזרות), אבל מספרים אלה יכולים להשתנות בהתאם החלבון לנתח את רמות הביטוי. כאשר photobleaching מתאים, אתה צריך לראות &quot;חור שחור&quot; של הקרינה GFP שלך. החור השחור הוא בהדרגה מחדש מלא התאוששות בעקבות הקרינה. למרות דיסק ספינינג יכול לקבל עד כ -60 תמונות לשנייה (עם עוצמת הקרינה טוב כאשר התקרבות על תא בודד), לא מומלץ להשתמש במערכת במהירויות גבוהות כאלה, בשל איכות התמונה נמוכה phototoxicity גדל פוטנציאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי FLIP, להגדיר פרוטוקול הדמיה שונים: אוספים 3-5 מסגרות לפני הלבנה, ולאחר מכן להתחיל לחזור הלבנה באותו מקום בעת איסוף התמונות. עבור H1e-GFP, אקונומיקה כל 5 שניות, עבור H1o-GFP, אקונומיקה כל 2 שניות, ועל HP1-GFP אקונומיקה כל 1 שניות. Bleachד לאסוף תמונות שוב ושוב לאורך הניסוי כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור טכניקה או, לחזור על התהליך על 20-30 תאים. למטרות סטטיסטיות, חזור על הניסוי 3 פעמים או יותר, רצוי בימים שונים. באוכלוסיות הומוגנית ההגדרות הנכונות, סטיית התקן היא נמוכה בדרך כלל (&lt;5%). עבור FRAP והן FLIP, בגודל ובצורה של האזור מולבן משפיע על הדינמיקה ההתאוששות חייבת להישאר קבועה בתוך ניסוי. כמו כן, כאשר שני תאים מושווים, פרוטוקולים זהים יש להשתמש בתאים יש לנתח ברצף באותו היום כמו לייזר כוח ומצבים אחרים עשויים להשתנות והם עלולים להשפיע על תוצאות הניסוי. </li></ol> 4. FRAP ולהפוך ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל מסגרות FRAP שנאספו, למדוד את עוצמת הקרינה את ההחזר על ההשקעה (ROI b = שטח מולבן), האזור רקע (ROI bg), והשטח לא מולבן גרעיני (ROI nb) כפונקציה של זמן לפני ואחרי הלבנה. כאשר אזור מחומצן הוא זניח בגרעין כולו ניתן לבחור למטרות נורמליזציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודת זמן, לנרמל את הנתונים לפי הנוסחה: (ROI ב - ROI bg) / (ROI nb - ROI bg) / (pbROI ב - pbROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg), pb מציין מראש מולבן. במשך מראש אקונומיקה תמונות אתה צריך לקבל ערך של כ 1. התמונה הראשונה לאחר להלבין את יציין את עומק Bleach. הפחת את הערך 1 עבור הערך Bleach בפועל עומק. חזור על הפעולה עבור כל תא וממוצע 20-30 תאים כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל מסגרות FLIP שנאספו, למדוד את עוצמת הקרינה באזור הלא מולבן הגרעיני, ואזור רקע (ROI nb = לא מולבן באזור, ROI bg רקע =). חישוב נתונים FLIP דומה עקומת FRAP, רק את ההחזר על ההשקעה ניתחו (ROI nb) צריך להיות שונה מאשר באזור מולבן בפועל, אשר אינו משמש לצורך חישוב: (ROI nb - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) . אפשר גם להשתמש בתא השכן (ROI = n התא השכן) למטרות נורמליזציה: (ROI nb - ROI bg) / (n ROI - החזר על השקעה bg) / (pbROI nb - pbROI bg) / (n pbROI - pbROI bg ). לאחר איסוף הנתונים, ניתן להתאים את נתוני הניסוי על הדמיית מחשב. זה מאפשר חישוב, עם הקרבה טוב, את החלק היחסי ניידים, חלק נייח לבין חצי מקסימלית. אנחנו לא נדון בהיבטים מתמטיים וניתוחים סטטיסטיים של FRAP כאן מפנים את הקורא פרסומים מעולה אחרים 4-9. עומק אקונומיקה מתייחס למרחק (על ציר y) בין האות (100%) מראש אקונומיקה התמונה הראשונה אחרי אקונומיקה, שבר ניידים מתייחס למרחק (על ציר ה-Y) בין עומק אקונומיקה את האות כאשר התאושש קינטיקה מגיע הרמה, ואת חלק נייח מתייחס למרחק (על ציר ה-Y) בין האות התאושש מראש אקונומיקה (100%) אות (ראה איורים 1B ו -2). מעבר לניתוח זה, יש מודלים מתמטיים טוב כדי להתאים את הנתונים. עבור המעריך אחת, את המשוואה  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="משוואה" width="80" /> כאשר t הוא הזמן, הוא חלק ניידים, 1-A הוא חלק נייח ו k את זה ניתוק תמידי, יכול לשמש כדי להתאים את הנתונים, הערכה ישירה של שיעור הנחה של הכריכה (k כבוי) ניתן המתקבל, כמו גם עבור הפרמטר A, אשר יכול לשמש כדי לחשב את שיעור העמותה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ונציג B להראות FRAP הקימורים של HP1 (משמאל), H1o (באמצע) ו H1e (מימין) בתאי גזע עובריים R1. עבור איור פשטות ובהירות 1A מציגה את הנתונים הגולמיים של תא בודד לפני נורמליזציה כלשהי בחישוב. עקומת צהוב מתאים באזור מולבן, עקומת סגול המתאים לאזור הלא מולבן הגרעיני (כאשר אזור מחומצן הוא זניח הגרעין כולו ניתן לבחור למטרות נורמליזציה), ואת הקו האדום מתאים פלואורסצנציה הרקע, אשר מינימלי במקרה זה. החץ האנכי מייצג את הזמן אקונומיקה. נתונים מנורמל ממוצעים של מוצג באיור 1B. הערה התאוששות איטית של H1 (בכחול) לעומת HP1 (אדום). כמו כן, הגרסה H1e (כחול כהה) היא איטית יותר מאשר הגרסה H1o (תכלת). שברים נייד נייח ו Bleach עומק מצוינים עבור HP1. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. A ו-B להראות נציג FRAP עקומות השוואת euchromatin (משמאל) עם heterochromatin (מימין) של HP1 R1 בתאי גזע עובריים. בדומה איור 1, איור 2 א מראה הנתונים הגולמיים של תא בודד, עקומת צהוב מתאים באזור מולבן, עקומת סגול המתאים לאזור הלא מולבן הגרעינית, ואת הקו האדום מתאים פלואורסצנציה הרקע. החץ האנכי מייצג את הזמן אקונומיקה. נתונים מנורמל ממוצעים של מוצג תרשים 2B. הערה התאוששות איטית של heterochromatin (אדום כהה) לעומת euchromatin (אור אדום). שברים נייד נייח ו Bleach עומק מצוינים עבור euchromatin. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3.. הניסוי FLIP אופייני H1o תאים R1 ES מוצג באיור 3 א (גולמיים, בלתי מנורמל נתונים) ו-B (נתונים ממוצעים של מנורמל). בניסוי זה את עקומת סגול המתאים לאזור הלא מולבן הגרעיני, הקו הירוק מתאים גרעין התא השכנות הקו האדום מתאים פלואורסצנציה הרקע.

<ol>
	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שלא כמו בשיטות הזמינות ביותר, אשר כרוך הכרומטין מטוהרים מן אוכלוסיות תאים או תאים קבוע, ניסויים FRAP בעקבות שינויים הדינמיקה חלבון הכרומטין בתאים חיים. מצאנו הדינמיקה הכרומטין חלבון להיות אינדיקטור טוב עבור פלסטיות הכרומטין. עם זאת, מכיוון שהיא דורשת פיוזינג את הגן של עניין עם ה-GFP, תוספת של תג פלורסנט יכול להפריע לתפקוד של חלבונים. לכן, לפני שתמשיך FRAP, החלבון היתוך חייבים להיבדק בקפדנות כדי להבטיח לו את אותן התכונות והתפקוד כמו עמיתו המקורית שלו. תקן הזהב יהיה להשלים את הפונקציה של חלבון אנדוגני עם פיוז&#39;ן-GFP בשורה תא בנוקאאוט. עם זאת, שורות תאים נוקאאוט לא תמיד זמינים, ובמקרים רבים היעדרותו של חלבון אין פנוטיפ ברור. עם זאת, אפשר לבדוק הפצה subcellular החלבון של היתוך, ברמת הביטוי שלו, שותפים מחייב, הכל בהשוואה לחלבון אנדוגני כדי להבטיח החלפת חלקי הנכון. לאחר האימות, חלבון ה-GFP היתוך חייב להיות transfected לתאי גזע עובריים. מצאנו כי מעבר עובד היטב עם תאים ES ו משיג יעילות transfection של מעל 50%. Transfection חלוף נוח כפי שהוא מאפשר שתמשיך הניסוי ישירות, אבל transfection יציבה היא לעתים קרובות מעולה, הבטחת ההישרדות לטווח ארוך של התאים בנוכחות החלבון היתוך של ריבית, וכתוצאה מכך נמוך ורמת הביטוי הומוגנית. שיטות נוספות של תיוג חלבונים עם תגי ה-GFP כוללים תיוג GFP גנים BACS באמצעות 10 combineering או GFP השמנה גנים אנדוגניים ישירות עם ה-GFP / YFP אקסונים 11, 12. שיטות אלה עדיפים, כמו חלבון היתוך הוא מונע על ידי האמרגן אנדוגני, אבל לא תמיד זמין. Transfection של BACS לתאי גזע עובריים ניתן באמצעות שיטות transfection סטנדרטי. לבסוף, תאים ES מן העכברים הטרנסגניים המבטא את החלבון הכרומטין מתויג יכול לשמש גם. אמנם מסורבל יותר, שיטה זו מאפשרת את השימוש של תאים מעבר מוקדם, שלא כמו תאים transfected ביציבות, אשר דורשים culturing לטווח ארוך כדי להשיג מבחר טהורה אינטגרציה יציב. לאחר חלבון של עניין נבחרה, התמזגו עם GFP, וידוא transfected לתאי ES, ישנם מספר תנאים הכרחיים כי יש לקיים עבור ניסוי FRAP מוצלח: ראשית, את האות ניאון כדי להיות מולבן יש להבחין בבירור על רקע כל האות; השני, photobleaching חייב להיות מהיר יחסית לתקופה של התאוששות לספק פתרון זמני מספקת ניתוח של עקומת ההתאוששות כדי לאפשר מדידה של זמן וחצי של התאוששות. לכן, הלייזר המשמש להלבנה צריך להיות חזק מספיק כדי לאפשר זאת, שלישי, את קרן ניטור חייב להיות בעוצמה נמוכה כדי לצמצם photobleaching. מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal, מצויד ביכולות photobleaching (כגון אנדור המהפכה במערכת), ולכן הוא אידיאלי למטרה זו. לבסוף, תא סביבתי שמירה על תאים על תנאי הגידול הנכון חייב להיות מותקן על מיקרוסקופ כדי להבטיח הומאוסטזיס בתא הנכון. מגבלה עיקרית בעת ניתוח ההיסטונים הליבה היא שהם הדוק ל-DNA, ועל כן, בניסויים FRAP הם מופיעים כמעט ללא תנועה. כדי להגיע להחלמה מלאה של ההיסטונים הליבה, עקומות FRAP צריך להגיע כמה שעות. מכיוון שתאי גזע עובריים הם ניידים מאוד בתרבות, הוא למעשה בלתי אפשרי מבחינה טכנית לבצע שעות ארוכות ניסויים FRAP. כדי למנוע זאת, ניתן לבצע עד 10 דקות ניסויים FRAP ולהקיש את ההתנהגות הקינטית של דקות עד שעות. בניגוד ההיסטונים הליבה, רוב חלבונים מחייב DNA במהירות לשייך לנתק מן הכרומטין, וכתוצאה מכך מחצית חיים קצר, כדי של שניות עד מספר דקות בשעה 1 ביותר. במאמר זה למדנו שני חלבונים DNA מחייב, H1 ו HP1, הן דינמיות בתאי גזע עובריים, אך HP1 היא דינמית יותר H1 (כפי שמוצג באיור 1). יש לציין, הן החלבונים האלה הם דינמיים הכרומטין פחות מאשר heterochromatin euchromatin, ולכן ההתאוששות לאחר הקרינה photobleaching של heterochromatin הוא איטי (כפי שניתן לראות באיור 2). ההתאוששות איטית יותר heterochromatin סביר משקף ריכוז גבוה של אתרי קישור H1 ו HP1 כמו גם הצפיפות המולקולרית. לסיכום, הניסויים photobleaching לספק אמצעי ללמוד הדינמיקה חלבון הכרומטין בתאים חיים, המשקף פלסטיות הכרומטין, שהוא מוגזם בתאים pluripotent.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> סיגמא </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> לטין </td><td> מרק </td><td> 1.04078 </td></tr><tr><td> Opti-ממ </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8-μ היטב-שקופיות </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) לאפשר את לימוד הדינמיקה חלבון בתאים חיים עם רזולוציה במרחב ובזמן טוב. כאן אנו מתארים כיצד לבצע FRAP מבחני FLIP של חלבונים הכרומטין, כולל H1 ו HP1, בעכבר גזע עובריים (ES) התאים. בניסוי FRAP, תאים transfected, או transiently או ביציבות, עם חלבון של עניין התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או נגזרים ממנו (YFP, CFP, שרי וכו &#39;). ב, תאים transfected fluorescing, קרן לייזר ממוקדת הלבנה אינטנסיבי באזור קטן יחסית של עניין (ROI). אורך גל לייזר נבחרה על פי חלבון פלואורסצנטי המשמש היתוך. אור לייזר בלתי הפיך הלבנה אות הניאון של מולקולות ROI ו, מיד לאחר הלבנה, ההתאוששות של האות ניאון באזור מולבן - מתווכת על ידי החלפתו של מולקולות מולבן עם מולקולות מולבן - מנוטר באמצעות לשגות הדמיה הזמן. עקומות שנוצר התאוששות הקרינה לספק מידע על ניידות של החלבון. אם מולקולות ניאון הם נייח, ההחלמה לא הקרינה יקויימו. בגישה משלים, אובדן הקרינה photobleaching (FLIP), קרן הלייזר הלבנה באותו מקום שוב ושוב את עוצמת האות נמדדת במקום אחר בתא fluorescing. ניסויים FLIP ולכן למדוד דעיכה אות ולא התאוששות פלואורסצנטי מועילים כדי לקבוע ניידות חלבון, כמו גם חלבון מדלג בין תאים סלולריים. מחייב חלוף הוא רכוש משותף של הכרומטין הקשורים חלבונים. אמנם חלק גדול של כל חלבון הכרומטין חייב הכרומטין בכל רגע נתון על מצב יציב, מחייב הוא חולף וחלבונים הכרומטין ביותר יש תחלופה גבוהה על הכרומטין, עם זמן מגורים בסדר גודל של שניות. מאפיינים אלה הם קריטיים ליצירת גמישות גבוהה בביטוי הגנום 1. ניסויים photobleaching ולכן הם יעילים במיוחד כדי לקבוע פלסטיות הכרומטין באמצעות GFP-Fusion גירסאות של חלבונים מבניים הכרומטין, במיוחד בתאי גזע עובריים, שם החליפין הדינמי של חלבונים הכרומטין (כולל חלבון heterochromatin 1 (HP1), היסטון H1 מקשר ו ההיסטונים הליבה) גבוה מ בתאים הבדיל 2,3.

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

אנו מתארים שיטות photobleaching כולל שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) כדי לעקוב אחר הדינמיקה חלבון הכרומטין בתוך גזע עובריים (ES) התאים. הכרומטין הדינמיקה חלבון, אשר נחשב אחד האמצעים ללמוד פלסטיות הכרומטין, מוגברת בתאים pluripotent.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

photobleaching-assays-frap-flip-to-measure-chromatin-protein-dynamics

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

27.0K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. אנו מתארים שיטות photobleaching כולל שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) כדי לעקוב אחר הדינמיקה חלבון הכרומטין בתוך גזע עובריים (ES) התאים. הכרומטין הדינמיקה חלבון, אשר נחשב אחד האמצעים ללמוד פלסטיות הכרומטין, מוגברת בתאים pluripotent.

Video: Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

דפוסים של תאים עובריים באמצעות שבב להעיף ביו

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...