ברצוננו להודות Hung גואו-Chiuan ד ר ד ר Bharatkumar ג'ושי להערות יקר זה לשפר את כתב היד.

כל הניסויים שנערכו במחקרים אלה בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש במתקן המחקר והתרופות האמריקני (FDA) ואוכל.
1. בידוד והתרבות של העכבר מתחלקים Fibroblasts (MEFs)
<ol><li>לבודד את העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) זן PP2A-B56γ-עכבר, הארנבונים מאותה פראי סוג ב פרוטוקול סטנדרטי 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs עבור 3 קטעים, להקפיא ולאחסן עד לצורך ניסויים 8.</li>
</ol>2. culturing Mefs 2-ובכן תאיים כיסוי זכוכית עבור Live הדמיה
<ol><li>הכנת 500 מ"ל של המדיה צמיחה MEF המכילה בינוני נשר שונה של Dulbecco (DMEM/F12) עם 10% סרום שור עוברית (FBS), 1 X פניצילין/סטרפטומיצין אנטיביוטיקה, -גלוטמין (200 מ מ) ו- 1 X חומצות אמינו שאינן הכרחיות (NEAA) בבקבוק 500-mL מדיה.</li>
	<li>הפשרת צלוחיות של MEFs קפוא מסוג הפרוע, PP2A-B56γ-עכברים-מעבר 3 באמבט מים מראש ומחוממת ב 37 º C.</li>
	<li>להעביר MEFs המופשרים 15-mL צינורות ולהוסיף לאט לאט dropwise 20 מ"ל של מדיה DMEM/F12 הצינורות 15-mL באמצעות פיפטה של 10-mL.</li>
	<li>העברת MEFs יחד עם 20 מ של התקשורת צמיחה DMEM/F12 T75 מבחנות ולהרחיב אותם עד התאים הם 70% confluent. Confluency מוערך באמצעות מיקרוסקופ הופכי ב 4 x או 10 x הגדלה.</li>
	<li>וביופסיה מדיום הגידול באמצעות מרעה זכוכית פיפטה המחובר למערכת ואקום בשכונה, להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול DMEM/F12 כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>Centrifuge התאים במהירות נמוכה-(x 300 גר') עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע והשהה מחדש בגדר תא ב 1 מ"ל של מדיום הגידול DMEM/F12 להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות שיטת מניעה כחול trypan או אחרים תאים מתאים ספירת השיטה 8.</li>
	<li>זרע כ 20,000 MEFs/טוב בכוס 2-ובכן chambered כיסוי. להוסיף 200 µL/טוב DMEM/F12 מדיום הגידול ולאפשר לתאים לצרף על-ידי המקננת אותם בן לילה-CO 37 ° C ו- 5%2.</li>
</ol>3. סינכרון
<ol><li>סינכרון MEFs בשלב G0/G1 מאת המקננת בתאים DMEM/F12 צמיחה המדיה המכילה 0.1% FBS במשך 24 שעות ביממה, כדי לקבל מספר מרבי של תאים בשלב G0/G1. הערה: למרות הרעב סרום שימשה כשיטה של העדפה, שיטות שונות ניתן בהתאם mitotic השלב שבו תאים יש צורך להיות נעצר 10.</li>
</ol>4. תיוג
<ol><li>להכין מלאי תמיסת nocodazole ב דימתיל סולפוקסיד 1.5 mg/mL. Nocodazole מעצרים תאים בשלב G2/M על ידי עיכוב היווצרות microtubule 10.</li>
	<li>שלושה ימים פוסט סינכרון, להוסיף 200 200 ng/mL nocodazole µL של מדיום הגידול (עם 10% FCS), ו- CL-HB ריג'נט (BacMam 2B-GFP-היסטון 2.0).</li>
	<li>לחשב ההנהלה CL-HB חלקיקים לכל תא (PPC) להוסיף תאים כדלקמן: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> איפה מספר התאים המספר הכולל המשוער של תאים בזמנו של תיוג, PPC הוא מספר החלקיקים לכל תא, 1 × 10-8 מספר החלקיקים לכל מיליליטר הכימית. לדוגמה, כדי תווית 20,000 תאים עם PPC של 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> הערה: CL-HB ריג'נט עובד טוב עם רוב סוגי תאים בין 10 ל-50 PPC. עם זאת, 30 PPC עבד בצורה הטובה ביותר במחקר זה.</li>
	<li>תקופת דגירה MEFs של 18 h-CO 37 ° C ו-5%2. הערה: עבור הניסוי הנוכחי, ויזואליזציה של הכרומוזומים בתאים mitotic בריחה במחסום הרכבה פלך אירעה 18 h לאחר מחזור התא מעצר עם nocodazole.</li>
</ol>5. ויזואליזציה של משתרך כרומוזומים
<ol><li>דמיינו העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) באמצעות מערכת דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי מצוידים עם חדר סביבתיים הטבילה שמן, 63 x עדשה אובייקטיבי.<ol>
<li>השתמש עירור גל של 488 ננומטר, פליטה גל 450 nm עבור ייבוא תמונות של ערוץ ה-GFP.</li>
		<li>להשתמש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם היכולת של שלבי סריקה ממונע, Z-Piezo מוסיף, העליונה שלב הדגירה ושחזור פלורסצנטיות ישיר לאחר צילום הלבנה על טכניקה זו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום אחד לפני הדמיה, להפוך על כוח סביבתי קאמרית, לחמם את החדר כולו ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להפעיל כוח על דוכן מיקרוסקופ, מצלמה, ספינינג דיסק יחידה, המאייר, ללייזר, המחשב ו הבמה ממונע.</li>
	<li>. תן למערכת לחמם 3 דקות; התחל את לייזר ארגון על-ידי הפעלת מפתח ההצתה. מתג הבורר דו-מצביים ללייזר ממצב "המתנה" "לייזר לרוץ".</li>
	<li>השקת התוכנה רכישת ועיבוד נתונים.</li>
	<li>ליזום הבקר2 CO עבור החממה העליון שלב ולהגדיר את ריכוז CO2 ב-5%. זה חייב להתבצע לפני תחילת הדמיה.</li>
	<li>הסר הזכוכית המכסה chambered החממה ואת המקום על הבמה עבור פריט חזותי. דמיינו תאים באמצעות עדשת המטרה 63 x טבילה (NA1.4) שמן.</li>
	<li>הצג מבעד לעדשות עינית, למקד את התמונה ולזהות תא בשלב מעטפת הגרעין התמוטטות (NEBD).</li>
	<li>ליזום המתאים לייזר (488 ננומטר לייזר ארגון לדמיין Histone2B-GFP).</li>
	<li>לפתוח חלון שליטה רכישה ולהגדיר זמן החשיפה לערוץ ה-GFP. לזהות תא הנמצא NEBD.<ol>
<li>באופן ידני לקבוע העליון תא היעד ואת התחתון במישור המוקד והזן את xyz אופטי חלוקתה הגדרות.</li>
		<li>במשך 20 דקות; אם התא לא ממשיך דרך חלוקת התא, להפסיק ייבוא תמונות לאחר 20 דקות ולהמשיך הלאה לתא הבא שנמצא NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כ 1 h בכל תא יש צורך התמונה לקרטע הכרומוזומים במהלך מיטוזה בתאים PP2A-B56γ-ברח מן השק. כדי לקבל נתונים עבור סרט, לצלם תמונות כל 3 דקות. הערה: פראי סוג התאים לעצור, לא התקדמות העבר NEBD כאשר מטופלים עם nocodazole.</li>
	<li>שמירת תמונות בתבנית קובץ צבי לצורך ניתוח נוסף.</li>
</ol>6. תמונה עיבוד וניתוח
הערה: לבצע עיבוד תמונה תלת-ממדית וניתוח באמצעות תוכנה זמינים כגון Axiovision גירסה 4.8.2 או Imaris גירסה 8.2. במחקר זה, ImageJ התוכנה היה בשימוש.
<ol><li>פתח את רצף תמונות. אם התמונות הן כבר בתבנית מחסנית, המשך לשלב הבא. אם לא, לשלב כל תמונות רלוונטיות באמצעות מחסנית ' תמונה > ערימות > תמונות למחסנית ' בשורת התפריטים.</li>
	<li>לבצע כיוונונים כנדרש בהירות/חדות, רמות.</li>
	<li>כדי להוסיף חותמת זמן הסרט:<ol>
<li>עבור אל ' תמונה > ערימות > תווית. ' בשורת התפריטים.</li>
		<li>בחר תבנית המתאימה את הערך ההתחלתי של הזמן, מרווח הזמן בין כל תמונה.</li>
		<li>סמן את התיבה 'תצוגה מקדימה' והתאם הגדרות מיקום ותבנית. לחץ על 'אישור' כדי להחיל חותמת הזמן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להוסיף פס סולם לסרט:<ol>
<li>להגדיר את התמונה דרוג תחת ' נתח > קבע קנה מידה ' בשורת התפריטים.</li>
		<li>בשדה 'מרחק בפיקסלים', הזן מספר הפיקסלים שבו המרחק ידוע ולאחר בשדה 'מרחק ידוע' הזן את המרחק. הגדר את יחידת הנכון של אורך על המרחק, למשלמיקרומטר לחץ על 'אישור' כדי להחיל את קנה המידה על הערימה.</li>
		<li>עבור אל ' נתח > כלים > סולם והבעת ' כדי להוסיף סרגל קנה מידה. להגדיר את הגודל של הבר כמו 'רוחב מיקרומטר', והתאם את הנותרים אפשרויות בהתאם לצורך עיצוב. סמן את התיבה 'תווית כל הפרוסות' כדי להוסיף את סרגל קנה מידה הערימה כולה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תצוגה מקדימה של הסרט על ידי לחיצה על כפתור play משולשים בתחתית לקצה של חלון תמונת הימני. להתאים את קצב המסגרת באמצעות ' תמונה > ערימות > אנימציה > אפשרויות הנפשה בשורת התפריטים.</li>
	<li>ייצוא קובץ הסרט על-ידי בחירת ' קובץ > שמירה בשם > אבי. ' ובחר את קצב המסגרות ואת הדחיסה.</li>
	<li>לחץ על 'אישור' כדי לבחור השמירה שם קובץ ומיקום. לחץ על 'שמור' כדי לשמור את קובץ הסרט.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li><li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+and+cancer:+cutting+through+the+mystery.">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis.">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li><li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer.">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li><li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+phosphatase+2A+B56&#947;+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development.">The protein phosphatase 2A B56&#947; regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).</li><li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP2A-B56&#947;+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint.">PP2A-B56&#947; is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites.">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).</li><li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

מחזור התא שליטה מחסומים להבטיח הפרדה בין כרומוזום מדויק למנוע אנאפלואידיה ותא טרנספורמציה 1,2,3. במחקר הנוכחי, מצאנו את איון של PP2A-B56γ, גרמו מחסום הרכבה פלך נחלש. הדמיה חיה תא אפשר לנו להתבונן כרומוזומלית סגרגציה שגויה במהלך מיטוזה ב PP2A-B56γ ME...

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים שיטה נוחה להמחיש סגרגציה כרומוזומלית והתקדמות mitotic במהלך מחזור התא בהעכבר מתחלקים fibroblasts באמצעות היסטון 2B-GFP, BacMam 2.0 תיוג והדמיה תא חי.
מחזור התא שליטה מחסומים לפקח על כרומוזום סגרגציה, יש תפקיד חשוב בשמירה על שלמות גנטי של התא 1,2,3. הצטברות של כרומוזומים אי הפרדה יכול להוביל aneuploidy, אשר מהווה סימן היכר של גידולים מוצקים ביותר 4. לפיכך, זיהוי מפגרות כרומוזומים יכול לשמש כשיטה ללמוד יציבות כרומוזומלית.
Fluorescently שכותרתו חלבונים יכולים להיות בשימוש לדמיין חיים כרומוזום סגרגציה, כרומוזומלית מפגרות אבל הדור של מתויג mCherry או חלבון ויזת עבודה H2B-GFP מתויג דורש ידע משמעותי של ג'ין משלוח וביולוגיה מולקולרית 5. כאן נתאר את השימוש ריאגנט CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, להלן בשם ריג'נט CL-HB, למען הפשטות. ריאגנט הזה יכול לשמש מיד ומסלקת ובכך חששות לגבי וקטורית באיכות ויושרה. בנוסף, ריאגנט הזה אינו דורש את השימוש טיפולים מזיקים או שומנים וכימיקלים העמסה לצבוע. שלא כמו תוויות פלורסנט קונבנציונלי, ההנהלה CL-HB כתמים ללא תלות פונקציה (כלומר., קרומית אפשרית). ההנהלה CL-HB יכול להיות פשוט להוסיף את התאים, מודגרות ללילה עבור ביטוי חלבון. ההנהלה CL-HB לא לשכפל תאים בתרבית של, ניתן להשתמש בהגדרות מעבדה 1 (BSL) אבטחה ברמה. בנוסף, ניתן להבחין תקנים ארעי זה לאחר לילה דגירה עד 5 ימים, מספיק זמן כדי לבצע ניתוחים הסלולר הדינמיים ביותר.
לחלופין, העיוותים כרומוזומלית יכול להילמד על ידי טכניקות שונות כגון cytometry זרימה, אימונוהיסטוכימיה או קרינה פלואורסצנטית באתרו הכלאה (דגים) 6. Cytometry זרימה ניתן ללמוד aneuploidy, אשר ניתן למדוד בהתבסס על תוכן ה-DNA, השלב של תאים במחזור התא. למרות cytometry זרימה יכול לשמש כדי למדוד aneuploidy, אינה מספקת מידע על סגרגציה שגויה כרומוזומלית. דגים וטכניקות אימונוהיסטוכימיה להשתמש הגששים פלורסנט כדי לאגד דנ א או כרומוזומים. ואילו טכניקות אלה מספקים תמונת המצב של אוכלוסיה של התאים, הם אינם מאפשרים תא חי הדמיה ובכך חסר מידע שהושג דרך ייתכן החזיית ציטוקינזה תאים מסוימים אחריו על פני תקופה של זמן.
פרוטוקול זה שימש ללמוד לקרטע כרומוזומים או סגרגציה שגויה כרומוזומלית ב nocodazole התייחסו העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) מבודד PP2A-B56γ-עכברים. בתוספת מעל היישום, פרוטוקול זה מספק כלי פשוט כדי לתייג והמחש כרומוזומלית הפרדה בין סוגי תאים שונים אשר יכול לשמש כדי ללמוד מחזור התא תקנה או בחוסר יציבות כרומוזומלית תאים סרטניים. בנוסף, זה יכול לשמש גם ללמוד יציבות כרומוזומלית נגרמת על ידי טיפולים תרופות שונות, או לחקור את ההשפעות של ג'ין מדהימה וכתוצאה מכך כרומוזומלית סגרגציה שגויה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:128px;">11320082</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered saline</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>MX 1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryogenic vial storage boxes</td>
			<td style="width:135px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">10-500-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cryogenic vials</td>
			<td style="width:135px;">Corning/costar</td>
			<td align="right">431416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:135px;">Cellstar</td>
			<td align="right" style="width:128px;">658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">2 well chambered cover glass</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td style="width:128px;">155380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cellometer Vision Cell Profiler</td>
			<td style="width:135px;">Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td style="width:128px;">Cellometer Vision Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:128px;">C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td>
			<td style="width:135px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td style="width:128px;">Zeiss Cell Observer SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Water Bath</td>
			<td style="width:135px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:128px;">280 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Incubator</td>
			<td style="width:135px;">Sanyo commercial solutions</td>
			<td style="width:128px;">MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Class II Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:135px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:128px;">SterilGard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Axiovision software</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:128px;">Ver.4.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:135px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:128px;">Ver. 1.51r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

כרומוזומים חייב להיות אמין, בצורה אחידה הפרדה לתאי הבת במהלך חלוקת התא mitotic. נאמנות של סגרגציה כרומוזומלית נשלטת על ידי מנגנונים מרובים הכוללים את מחסום הרכבה פלך (שק). הקרום הוא חלק מערכת משוב מורכבים כי הוא אחראי למניעת התקדמות התא באמצעות מיטוזה אלא אם כל kinetochores כרומוזומלית יש מחובר ציר microtubules. לקרטע כרומוזומלית, כרומוזום נורמלית סגרגציה הוא מחוון של מחזור התא לקוי שליטה מחסומים והוא יכול לשמש כדי למדוד את יציבות גנומית של חלוקת תאים. הסרת הפיקוח של הקרום יכול לגרום הטרנספורמציה של תאים נורמליים לתא ממאיר דרך ההצטברות של שגיאות במהלך ההפרדה כרומוזומלית. יישום של השק ואת היווצרות קינטוכור מורכבים מוסדרים בחוזקה על ידי אינטראקציות בין kinases פוספטאז כגון 2A חלבון פוספטאז (PP2A). פרוטוקול זה מתאר תא חי הדמיה של משתרך כרומוזומים בתוך העכבר מתחלקים fibroblasts מבודד מן העכברים היה נוקאאוט של יחידת משנה התקינה PP2A-B56γ. שיטה זו גוברת על החסרונות של מחזור התא שליטה הדימות האחרות כגון cytometry זרימה או immunocytochemistry רק לספק תמונת מצב ציטוקינזה תא, במקום פריט חזותי ייתכן דינמי של כרומוזומים במהלך מיטוזה.

MEFs פראי סוג ו PP2A-B56γ-עכברים נזרע בכוס כיסוי תא 2-ובכן, מותר לצרף. יום 2, MEFs סונכרנו באמצעות 0.1% FBS במשך 24 שעות ביממה. יום 3, MEFs בתקשורת עם 200 ng/mL nocodazole ו 30 regentwere PPC CL-HB מודגרות עבור 18 h ב- 37° C ו- 5% CO2. יום 4, התאים היו עם תמונה באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis at JoVE.com

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

live-cell-imaging-of-chromosome-segregation-during-mitosis

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

9.2K Views.  US Food and Drug Administration. פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.

Video: Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

ניתוח של הפרדת כרומוזום, אצטון היסטון, ומורפולוגיה ציר ב סוס ביציות

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-הדמיה של