אנו מודים המכונים הלאומיים לבריאות (1R21CA138373 ואת לעמוד סרטן (SU2C) עבור תומך הכספיים של עבודה זו. ח.י. היא אסירת תודה על פרס 2009 עליון מן האגודה האמריקאית לחקר הסרטן, פרס המלומד קימל מן סידני קימל קרן לחקר הסרטן (SKF-08-101), ואת הקרן הלאומית למדע הקריירה המוקדמת הפקולטה פרס (NSF0954819).

1. שיבוט שיקולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotides מוכן מסחרית המייצגת את TMD עניין מוקף NheI ואתרי BamHI הגבלה 5&#39;-פוספורילציה ניתן ligated לתוך pTox7 (שונה במעבדה שלנו על ידי החדרה של זוג אחד בבסיס ישירות אחרי האתר מגבלה BamHI 14) (איור 3) מתעכל ברצף עם BamHI ו NheI. Oligonucleotide דוגמה מוצג להלן: 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &quot; 3 &quot;gTMDSEQUENCEcctag5&quot; </li></ol> רצף TMD צריך להיות 12-24 שאריות (רצפים קצרים יותר יהיה כנראה להיות מוארך על ידי וקטור שאריות מקודדים הידרופובי). על מנת לחקור את הממשק, ארבע גרסאות של עיצוב TMD יש ליצור שם הוספות שאריות רציפים שאריות מחיקות במקביל לגרום סיבוב של קרוב ל TMD ToxR. 15,16 לבסוף, ריכוז arabinose צריך להיות נע בין 0.001 ו - 0.01% (w / v) כדי לזהות את הריכוז המרבי שבו ההבדלים β-galactosidase אותות בין רצפים שונים TMD הם נצפו; בדיקת רמות ביטוי שונות מומלץ לזהות את התנאים בהם זיקות שונות ניתן להבחין בין הטוב ביותר. בנוסף arabinose ואנטיביוטיקה, 0.4 mM IPTG יכול לשמש כדי לשפר את ההבדלים של זיקות בין TMDS שונים. המדידה ToxR יש לבצע לפחות ארבע פעמים. ההליך כולו יש לחזור לפחות שלוש פעמים עם הפלסמיד טרנספורמציות שונות. 2. צמיחה של תרבויות חיידקית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפשיר FHK12 תאים המוסמכת (200 μl) על הקרח ולהעביר לתוך צינור תרבות 15 מ&quot;ל. הוסף ה-DNA פלסמיד (200 ng) ו דגירה התאים על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום הלם תאים על ידי הדגירה של 90 על 42 מעלות צלזיוס, ואחריו הדגירה על קרח דק &#39;2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף SOC התקשורת (800 μl) ו דגירה דגימות ב 37 ° C עם רועד (300 סל&quot;ד) אחד ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 LB התקשורת מ&quot;ל עם chloramphenicol (30 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו arabinose (0.0025% w / v) עם 50 μl של התערובת שינוי ב 15 תרבות צינורות מ&quot;ל בשלושה עותקים. דגירה דגימות ב 37 ° C עם רועד (300 סל&quot;ד) למשך 20 ח (לחלופין 5 μl של התרבות ניתן לחסן 100 μl של המדיום בצלחת 96-היטב. שיטה זו יעילה כאשר מדובר במספרים גדולים של דגימות, למרות שגיאות יהיה מעט גבוה יותר. על מנת למנוע אידוי, אשר יוביל טעות, למלא את בארות החיצונית עם התקשורת, אבל לא להשתמש בהם דגימות. לבסוף, פעמיים לעטוף את משותף בין המכסה את הצלחת עם parafilm). </li></ol> 3. מדידה של פעילות β-galactosidase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את צלחת הקורא 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ה-Z כליקול לתוך מאגר עם טיפ גדול פיפטה, מקפיד לקחת רק את השכבה העליונה (מימית). העברת 100 μl של Z-buffer/chloroform מוכן טרי על בארות צלחת 96-היטב. העברת 5 μl של כל תרבות לתוך בארות הצלחת ארבע פעמים. השמט את התרבות מארבע הבארות אשר תשמש את החסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 595 הצלחת לקבוע צפיפות התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של Z-buffer/SDS לכל הבארות של הצלחת. לנער את הצלחת לקורא הצלחת עבור 10 דקות עד lyze התאים. ודא השעיות תא ברורים לאחר תמוגה וחזור על צעד רועד אם נדרש. תמוגה הושלמה מציע את Z-buffer/chloroform לא היה מוכן טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl מוכן טרי Z-buffer/ONPG לכל הבארות ולהחזיר את צלחת לקורא את הצלחת למדוד OD של 405 כל 30 דקות 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב β-galactosidase הפעילות באמצעות המשוואה הבאה (לזכור להפחית את ריק). יחס של 405 OD / min צריך להיות מחושב באמצעות כל נקודות הנתונים בטווח OD 405 0.0-1.0 באמצעות מודל ליניארי מתאים. <img src="files/ftp_upload/2721/2721eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> יחידות מילר שונים לפעמים כאשר רשמה בימים שונים. לכן, לבנות התייחסות כמו GPA צריך להימדד כל בדיקה. הערכים שלו יכול לשמש לנורמליזציה של ערכי ToxR. </li></ol> 4. הבקרה של ביטוי חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע המערבי סופג כדי לוודא אפילו ביטוי חלבון בין המבנים. שלב 50 μl של התרבויות בשלושה עותקים ו צנטריפוגה (2000 סל&quot;ד, 4 דקות) ב microcentrifuge. הסר את supernatant ידי pipetting ו resuspend גלולה שיורית 2 חיץ טעינת x המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 7.5 μl על ג&#39;ל 8% סטנדרטי ולבצע electrophoreses ב V 125 דקות, 1 שעה 5. לאחר ההעברה, דגירה עם נוגדן HRP-מצומדות אנטי MBP ולדמיין; חלבון כימרי הוא ציין בכ 70 kDa עם כמה מוצרים השפלה לראות לפעמים סביב 48 kDa. MBP אנדוגני הוא ציין גם 45 kDa (ראה איור 5). </li></ol>5. הבקרה של הכנסת ממברנה פרופר קו תא חסר חלבון מחייב מלטוז משמש כדי להעריך את ההכנסה קרום תקין של לבנות את TMD chimeric. כאשר גדל על התקשורת מינימלי עם מלטוז כמקור פחמן יחיד, רק תאים להביע קרום בלתי נפרד מוצר ביטוי עם חלבון מלטוז מחייב ממוקם כראוי periplasm מסוגלים לגדול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה PD28 תאים (כפי שתואר עבור FHK12 תאים) ו לחסן 2 מ&quot;ל של מדיום LB. לגדל את התאים ב 37 ° C עם רועד (300 סל&quot;ד) למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 3500 סל&quot;ד, 10 דק &#39;, 4 ° C ולשטוף ידי resuspension ב PBS (2 מ&quot;ל) על ידי pipetting עדין עם טיפ גדול או vortexing עדין. גלולה התאים (לעיל), לשטוף עם PBS בפעם השנייה, גלולה ו resuspend לבסוף PBS (1 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 25 μl של תאים resuspended לחסן 5 התקשורת מינימלי מ&quot;ל בשלושה עותקים לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (300 סל&quot;ד). קח OD 595 קריאות בין 15-25 שעות, בערך כל 2 שעות על ידי העברת 200 μl של כל דגימה לתוך צלחת 96-היטב וקריאה באמצעות צלחת הקורא. </li></ol> 6. נציג תוצאות: דוגמה לשימוש assay כתב ToxR תעתיק לנתח את הנטייה oligomerization של תחומים הטרנסממברני ב שמוצג באיור 4. בעבר אנחנו בחנו את oligomerization של תחומים הטרנסממברני מן multispanning קרום בלתי נפרד סמויה קרום חלבון חלבון-1 (LMP-1) על ידי טכניקות שונות, לרבות ToxR 14 תחום הטרנסממברני חמישה (TM5) הוצגה התערוכה נטייה חזקה oligomerize. זו באה לידי ביטוי גבוהה יחידות מילר, להשוות שליטה חיובית, GPA, רצף ומבוססת dimerizing. מוטציה מזיקה ב TM5, D150A, מפחית את היכולת של הרצף כדי oligomerize. LMP-1 TM1 לא oligomerize משמעותית ותערוכות אות נמוך מאוד מילר היחידה, בדיוק מעל האות עבור ריק, לא שינו FHK12 תאים. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig1.jpg" alt="איור 1" /> קריקטורה איור 1. המתארת ​​את assay כתב ToxR. תחום הטרנסממברני (TMD) מונע תוצאות oligomerization ב dimerization של ToxR והפעלה של שעתוק LacZ. מוצר הגן של LacZ, β-galactosidase ניתן לכמת כמדד הנטייה של TMD כדי oligomerize. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מחשוף hydrolytic של ONPG ידי β-galactosidase תוצאות בייצור של המינים קליטת אור O-nitrophenolate (ONP). <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. המפה פלסמיד של pToxR7. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. Assay נציג ToxR כתב תעתיק ניתוח הנטייה oligomerization של קרום סמוי חלבון-1 תחומים הטרנסממברני. תחום הטרנסממברני 5 (TM5) oligomerizes בתוקף, בעוד תחום הטרנסממברני 1 (TM1) מוצגים רק האינטראקציה החלשה. D150A מוטציה TM5 מפחית באופן משמעותי את יכולתה oligomerize. GPA נכלל כרצף בקרה חיובית dimerization חזק. ריק מייצג untransformed FHK12 תאים. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. כתם המערבי לביטוי חלבונים. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. PD28 assay השלמה לשלוט על הכניסה קרום הנכונה periplasm. בקרה שלילית מייצגת לבנות חסר חלבון מחייב מלטוז.

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease.">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li><li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li><li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase.">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li><li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg(2+)-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg(2+)+homeostasis.">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li><li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures.">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li><li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+into+membranes.">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li><li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane.">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li><li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay כתב תעתיק ToxR היא דרך קליל לזהות רצפי הטרנסממברני עם פוטנציאל oligomerize. מאז האינטראקציות מתרחשות בתוך הקרום הפנימי חיידקי, assay זה עוקף את הנושאים הקשורים תוקפו של מערכות הלומדים קרום כוזב סביבות. בהתחשב בכך שיבוט של TMDS מרובים לתוך פלסמיד אחד יכול בקלות להתבצע במקביל a...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> BamHI אנזים הגבלה </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> אנזימים Invitrogen נמצאו להיות יעיל יותר ספקים חלופיים </td></tr><tr><td> NheI אנזים הגבלה </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> אנזימים Invitrogen נמצאו להיות יעיל יותר ספקים חלופיים </td></tr><tr><td> 15 תרבות צינורות מ&quot;ל </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC התקשורת </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Made עד נפח המתאים מעוקרים ידי מעוקר. </td></tr><tr><td> LB התקשורת </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> L7275 </td><td> Made עד נפח המתאים מעוקרים ידי מעוקר. </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> CO 3 78 </td><td> פתרון במלאי של 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באתנול מאוחסן במקפיא </td></tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> פתרון במלאי של 2.5% (w / v) במים לאחסן במקפיא </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt כימיקלים </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן dodecylsulfate (SDS) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-כליקול </td><td></td><td></td><td> 16.1 גרם Na 2 HPO 4 5.5g לאא 2 PO 4 0.75g KCl 0.246g MgSO 4 בצע עד 1 ליטר, 7.0 pH </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 מ&quot;ל β-mercaptoethanol, 2 מ&quot;ל כלורופורם, להפוך עד 20 מ&quot;ל עם Z-כליקול. וורטקס עבור צנטריפוגות 1 דקות, 1 דקות ב 800 סל&quot;ד. בצע טרי כל צלחת. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 מ&quot;ג SDS מומס 10 מ&quot;ל Z-כליקול </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 מ&quot;ג ONPG ב 10 מ&quot;ל Z-כליקול. בצע טרי כל צלחת </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP נוגדנים חד שבטיים (HRP מצומדות) </td><td> חוד </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> התקשורת מינימלי עם מלטוז </td><td></td><td></td><td> 1 x M9 מלחים, מלטוז 0.4%, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל תיאמין, 2 מ&quot;מ MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96-היטב לתחתית צלחת שטוחה </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> פלייט קורא </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Multimode גלאי </td><td></td></tr><tr><td> המים באמבטיה </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> טלטול חממה </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

התצוגה פשטני של תחומים הטרנסממברני חלבון רק עוגנים bilayers פוספוליפידים מכבר מופרכת. במקרים רבים קרום פורש חלבונים התפתחו מנגנונים מתוחכמים ביותר של פעולה. 1-3 דרך אחת שבה חלבונים בממברנה יכולים לווסת את המבנים שלהם פונקציות היא על ידי מגע ישיר וספציפי של סלילים הידרופובי, להרכיב oligomers הטרנסממברני מובנים. 4,5 האחרונות הרבה העבודה התמקדה הפצה של חומצות אמינו נמצאו מועדף בהשוואה בתמיסה מימית לבין כוחות מולקולאריים שונים חלבון כונן העמותה. 6,7 עם זאת, מחקרים של הכרה מולקולרית בבית תחום הטרנסממברני של חלבונים עדיין מפגרת אלה בסביבת קרום מסיס במים אזורים. המכשול העיקרי שנותר: למרות הספציפיות מדהים זיקה כי oligomerization הטרנסממברני יכולים להשיג, 8 מדידה ישירה של הקשר שלהם הוא מאתגר. מתודולוגיות מסורתית להחיל ללמוד את תפקוד הממברנה נפרד חלבון יכול להיות הקשו על ידי שבחוסר הטבועה של רצפים תחת בחינה. תובנות Biophysical זכה ללמוד פפטידים סינתטיים המייצגים תחומים הטרנסממברני יכול לספק תובנה מבניים שימושי. עם זאת, הרלוונטיות הביולוגית של micellar את חומר הניקוי או מערכות liposome שימוש במחקרים אלה לחקות ממברנות הסלולר מוטלת בספק לעתים קרובות, לעשות פפטידים לאמץ מבנה יליד דמוי בתנאים אלה ועושה התנהגות פונקציונלי שלהם באמת משקפים את מצב הפעולה בתוך קרום יליד ? כדי ללמוד את יחסי הגומלין של רצפי הטרנסממברני ב bilayers פוספוליפידים טבעיים, פיתחה את מבחני המעבדה Langosch ToxR כתב תעתיק. 9 תחום הטרנסממברני עניין מבוטא חלבון כימרי עם חלבון מחייב מלטוז עבור מיקום periplasm ו ToxR לספק דו&quot;ח רמת oligomerization (איור 1). בעשור האחרון, קבוצות אחרות (למשל אנגלמן, דגראדו, שי) אופטימיזציה נוספת ויישומי assay זה כתב ToxR. 10-13 מבחני ToxR שונים הפכו להיות תקן הזהב לבחון חלבונים אינטראקציות קרום התא. אנחנו כאן להדגים פעולה ניסיוני טיפוסי שנערך במעבדה שלנו בעיקר כדלקמן פרוטוקולים שפותחו על ידי Langosch. שיטה זו החלה בדרך כלל שימושי ניתוח של תחום העמותה עצמית הטרנסממברני ב E. coli, שבו β-galactosidase ייצור משמש כדי להעריך את הנטייה oligomerization TMD. עם dimerization TMD-Induced, ToxR נקשר האמרגן ctx גרימת עד ויסות של הגן LacZ עבור galactosidase-β. Readout colorimetric מתקבל על ידי תוספת של ONPG לתאי lyzed. מחשוף hydrolytic של ONPG ידי β-galactosidase תוצאות בייצור של המינים קליטת אור O-nitrophenolate (ONP) (איור 2).

Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

הליך יעיל להעריך את הנטייה oligomerization יחיד לעבור תחומים הטרנסממברני (TMDS) מתואר. חלבונים כימרי המורכב TMD התמזגו ToxR באים לידי ביטוי למתח כתב החיידק. TMD-Induced oligomerization גורם dimerization של ToxR, הפעלת שעתוק וייצור חלבונים הכתב,-galactosidase.

דומיין הטרנסממברני Oligomerization הנטייה נקבע על ידי Assay ToxR

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

transmembrane-domain-oligomerization-propensity-determined-toxr

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Views.  University of Colorado at Boulder. הליך יעיל להעריך את הנטייה oligomerization יחיד לעבור תחומים הטרנסממברני (TMDS) מתואר. חלבונים כימרי המורכב TMD התמזגו ToxR באים לידי ביטוי למתח כתב החיידק. TMD-Induced oligomerization גורם dimerization של ToxR, הפעלת שעתוק וייצור חלבונים הכתב,-galactosidase.

Video: Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...