פרוטוקול זה מקל על המחקר של aminopeptidases עם מצבים אוליגומריים שונים ופעילויות תלויות אוליגומריזציה מאוזנות בין עמעום לא פעיל דודקאמרים פעילים. טכניקה קונבנציונלית זו יכולה להתבצע בקלות בכל מעבדה. ומלבד הצורך בגישה למתקן קריסטלוגרפיה של קורות או קרני רנטגן, אינו דורש התקנים מיוחדים.
עם הסתגלות מסוימת, שיטה זו עשויה להיות מיושמת על כל חלבון אחר עם פעילות או פונקציה התלויה במידה של אוליגומריזציה. כדי לעבד את נתוני הרנטגן, למשתמשים חייבת להיות הבנה מינימלית של קריסטלוגרפיה. אנו מזמינים את המשתמשים לעקוב אחר הדרכות, לבקר ב- XDS Wiki ולצפות בערכות לימוד של Phenix.
כדי לבצע בדיקת פעילות, להוסיף 25 microliters של 100 mM L-לאוצין p-Nitroanilide ל 965 microliters של 50 מילימולרים MOPS, 250 micromolar קובלט שני כלוריד ו 10% מתנול Pre דגירה תערובת התגובה באמבטיה יבשה 75 מעלות צלזיוס, לפני דילול האנזים לריכוז סופי micromolar אחד עם 50 מילימולים נוספים MOPS. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיקרוליטרים של אנזים מיקרומולרי אחד לתערובת התגובה והמערבולת את הפתרון שנוצר לפני החזרת התגובה לאמבטיה היבשה של 75 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משעה. כאשר הפתרון הפך צהוב, לעצור את התגובה עם מיליליטר אחד של 20% חומצה חומצית מערבולת את התערובת לפני המאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן להעביר aliquot של תערובת התגובה לתא ספקטרופוטומטר ולקרוא את סופגים ב 410 ננומטר נגד תערובת תגובה דגירה ללא אנזים, כשליטה שלילית. להכנת אפואנזים, להוסיף 10 microliters של 1, 10-phenanthroline פתרון מלאי 890 microliters של 50 מילימולרית MOPS, 0.5 אמוניום גופרתי טוחה ו 100 microliters של TmPep1050 מטוהרים. בדוק את אובדן הפעילות באמצעות בדיקת הפעילות כפי שהוכח ללא תוספת של קובלט שני כלוריד.
לאחר ההקפאה, להעביר את המדגם לתוך צינור דיאליזה להדיאליזה המדגם נגד 200 מיליליטר של 50 מילימולרים MOPS ו 0.5 אמוניום גופרתי טוחה בארבע מעלות צלזיוס. החלף את הדיאליזה עם חיץ טרי שלוש פעמים במהלך הדיאליזה 48 שעות ולאסוף מדגם מצינור הדיאליזה. באמצעות יחידות סינון אולטרה עם ניתוק 30 קילודאלטון, לרכז את המדגם בחזרה 100 microliters ולבדוק את הריכוז על ספקטרופוטומטר נפח ננו ב 280 ננומטר.
כדי להכין את dimers לדלל את האפואנזים לריכוז micromolar אחד ב 50 מילימולרי MOPS ו 0.5 אמוניום גופרתי טוחן, ולהדקיר את התגובה במשך שעתיים באמבטיה יבשה 75 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לרכז את דגימת האנזים כאשר לפחות 50 ריכוז microliter ולבדוק את המשקל המולקולרי לפי גודל הדרת כרומטוגרפיה. כדי לשפר את הצורה, הגודל והקריסטליות של גבישי החלבון, הוסיפו את הנפח המתאים של פתרון התגבשות ממוטב לירידה בגבישים כדי להביא את נפח טיפת הגביש ל-10 מיקרוליטרים.
מעבירים את טיפת צינור 1.5 מיליליטר מיקרו ולהוסיף 90 microliters יותר של פתרון התגבשות לזרע היטב. עבור כל דילול זרעים, יש להוסיף 500 מיקרוליטרים של רגנט התגבשות לאורך כל באר למספר בארות המתאים בצלחת התגבשות ולערבב שני מיקרוליטרים של דגימת חלבון עם שני מיקרוליטרים של רייגנט התגבשות ו-0.2 מיקרוליטרים של זרעים בתמיכה אחת של התגבשות לאורך כל באר. ואז לתקן את התומכים על כל באר של reagent התגבשות.
לקטוף קריסטל, למלא אמבטיה עם חנקן נוזלי לצלול כל בקבוקונים או סל המשמש לטיפול מדגם לתוך החנקן. טיפול בחנקן נוזלי מסוכן זה יכול לגרום לכוויות קור חמורות. הקפד ללבוש הגנות אישיות נאותות כמו כפפות קריוגניים ומנועי עיניים מגן.
הגדר לולאות איסוף לדוגמה בגדלים שונים בהתאם לגודל הגביש ולהשתמש במשקפת כדי לבחור טיפה המכילה גבישים. לאחר מכן השתמש בלולאה כדי לבחור בעדינות גביש מבודד מ באר אחת ומיד לצלול את הלולאה בחנקן נוזלי לפני הצבת הלולאה בקבוקון מתאים. למדידת מידות נקודתיות של דיפוזיה, צרו תיקייה שממנה יופעל XDS ואתרו את הנתיב לתמונות.
כדי להפעיל xdsme, הזן את הפקודה בחלון מסוף. לאחר XDS סיים את המשימה לבדוק את קובץ lp הנכון לציין את ההסתברות של קביעת קבוצת החלל, שלמות נתונים, הרזולוציה הגבוהה ביותר, פסיפס גביש ואיכות נתונים. לאחר בדיקת יומן XDS חסר טעם כדי להשיג את הסבירות של קבוצות רווח, השתמש בפקודות כדי להדק את xdsme עם פתרונות שונים של קבוצת חלל המוצעים על-ידי XDS, בתיקיה נפרדת כדי למנוע דריסת התהליך הקודם.
לאחר בחירת הפתרון הטוב ביותר בהתבסס על סטטיסטיקת הנתונים, הזן את הפקודות להפעלת XSCALE ו- XDSCONV. כדי לקבוע את השלב ללא פריט פיזור חריג, השתמש בקואורדינטות 4P X, Y, כדי להכין את המודל ההתחלתי להחלפה מולקולרית. מקובץ PDB, השתמש בעורך הקבצים PDB Phenix כדי לחלץ את מונומר A כדי לחתוך חומצות האמינו שלה אלנין.
הפעל X עם קובץ ההשתקפות שנוצר על-ידי XDSCONV והרצף כקלט. בדוק את קובץ יומן הרישום מ- Xtriage. שים לב להשלמות, למספר יחידות המשנה ביחידה האסימטרית, לאניסוטרופיה, לנוכחות טבעות הקרח ולמופע התאומים.
כדי להפעיל את Phaser-MR בפניקס להחלפה מולקולרית, בחר את קובץ ההשתקפות, את הרצף ואת מודל 4P six Y ההתחלתי נחתך בפוליאלנין ולחץ על הפעל. עם השלמת, לבדוק אם המודל נמצא ולבדוק את הציון של ההחלפה המולקולרית. ציון Z גורם תרגום של לפחות שמונה, מציין כי הפתרון הוא בהחלט נכון.
לאחר קביעת השלב לפי החלפה מולקולרית, בחר הפעל מבנה אוטומטי ולחץ על הפעל. כל הקבצים הדרושים יתווספו באופן אוטומטי. עם השלמתו, בדוק את המודל ב- COOT ולבנות ולמקד את המודל באופן ידני, על פי מפת צפיפות האלקטרונים ב- COOT.
באמצעות מודל זה, הרצף ואת נתוני העקמומיות כמו קלט, לחדד את המודל אוצרות ידנית Phenix, בהתייחסו Phenix כדי לעזור לבחור את האסטרטגיה הנכונה. לאחר עידון לבדוק את התוצאות, עידון חינם עבודת עידון חייב להקטין. מחווני MolProbity חייבים להיות מכובדים וחריגים עם מתאם חלל ריאלי נמוך, חייבים להיות מוגבלים.
כאשר המודל המעודן הטוב ביותר נוצר, להפעיל MolProbity בשרת ולבדוק את כל החריגים שזוהו על ידי התוכנית. ניתן להשתמש כרומטוגרפיה של הדרת גודל כדי לקבוע את המשקל המולקולרי לכאורה של החלבון המטוהר. מצב התגבשות של פפטיד, ניתן לייעל על ידי שינוי ה- pH לעומת ריכוז PEG סביב מצבו של עמום.
לדוגמה, הטוב ביותר TmPep1050 H60A H307A גבישים, הושגו 0.1 ציטראט נתרן טוחנת עם pH של 5.2 ו 20%PEG 3350 ריכוז, לאחר מחזור אחד של זריעת מיקרו כדי לשפר את גבישיות מיקרו. בניתוח זה, אינדקס נתונים הראה כי קבוצת החלל של הגביש TmPep1050 H60A H307A היה C2221, אבל XDS הציע פתרון אחר, קבוצת החלל MP. המבנה של TmPep1050 H60A H307A, ניתן להשלים לאחר מספר מחזורים של עידון אוטומטי וידני.
אישור המצב האוליגומרי עם משטח ממשק של 1, 710 אנגסטרום מרובע בין שני מונומרים ואנרגיה חופשית של היווצרות ממשק של מינוס 16.2 קילוקלוריות לכל שומה. כאן, תקריב של TmPep1050 H60A H307A אתר פעיל בהשוואה לאתר הפעיל של TmPep1050 עמום ו dodecamer ניתן לראות. בעת בניית מודל לדאוג לבנות רק את מה שאתה רואה בצפיפות האלקטרונים כדי למנוע פרשנות יתר, את הנתונים, ולקחת את הזמן כדי ללטש את המודל שלך.
המשקל המולקולרי של עמום ו dodecamer יכול להיקבע גם על ידי ספקטרומטריית מסה מקומית. והשיטות יכולות להיות שימושיות לגילוי אוליגומרים מעבר.
