המחברים מבקשים להודות למקורות המימון: מרכז הצבא-UNL למכניקת טראומה (DoD / נרו, # W911NF-11-1-0033, PI: ד&quot;ר Namas צ&#39;אנדרה), פרס ההדיוט UNL (26-1110-0033 -001 , PI: לים).

1. תא תרבות עצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מוח בין תאי עצב, האסטרוציטים, ושיתוף תרבותם עשויים לשמש כמודל לתא. כהדגמת היתכנות, pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים תא השורה מוצג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי neuroblastoma אדם SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) שנמצאים בתרבית על coverslips זכוכית בקוטר 18 מ&quot;מ. תאי הזרע בצפיפות של 3 × 10 3 תאים / 2 סנטימטר באמצעות תקשורת הצמיחה המורכבת מDMEM בתוספת סרום 10% שור עוברי ו1% פניצילין סטרפטומיצין. שקופיות זכוכית תרבית תאים נשמרות בCO 2 חממה 5% humidified ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את התמיינות התאים העצבית של תאי SH-SY5Y, תאים שטופלו באמצעי תקשורת נוספת עם תוספת חומצה רטינואית מיקרומטר 10 (ע&quot;ר) למשך 7 ימים עם תקשורת השתנה בכל ימים. ביום 7, תאים מוכנים להיות בלחץ. </li></ol> 2. ציוד לחץ קבוע: Kolsky בר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר Kolsky, דהveloped על ידי 1 Kolsky בשנת 1949, נעשה שימוש כדי למדוד את המאפיין המכאני של חומר בקצב טעינה גבוהה מאוד. המנגנון מורכב משני ברים עם מדגם דגש על קשר בין הסורגים. גל לחץ, יצר בשורת האירוע, מתפשט לדוגמא שבו הגל מתפצל לגל משתקף ומשודר. המתח במדגם פרופורציונלי לגל המשודר. במחקר זה, אנו מנצלים קאמריים pressurization תא כדי להיות ממוקם בין שתי חפיסות Kolsky הגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני ברי מסגסוגת האלומיניום (כל 6-מ &#39;אורך) מושעים על ידי מסבי נחושת מיושרת, ובתא לחץ קבוע תא מבחנה היא דחוק בין הסורגים. בר מעלה הזרם הוא בשורת התקרית עם מסת £ 130 נצמדה אל קצה אחד. מהדק חיכוך ממוקם במקום כזה שייתן את משך הדופק הרצוי. על ידי העוסק במהדק והידוק שקע מספריים בין המסה ותמיכת טעינה, סעיף מהדק המסה של בר האירוע הוא ג מראשompressed לרמה הרצויה. מכריח את בורג מחורצים הנועל את התפס להפסקה פתאומית במערכת הידראולית משחרר דחיסה מראש מאוחסנת במהירות ובכך יוצר לחץ דופק. זה מתפשט דרך סרגל האירוע, כונני הבוכנה הקאמרית הבדיקה, וpressurizes הנוזל ותאים בתוך התא אימפולסיבית. על הלחץ הקאמרי בתור יוזם דופק לחץ מתפשט במורד הבר המשודר. המתחים הקשורים בפולסים הלחץ בברים נמדדים במדדים מתחמים גבוהים התנגדות מתח נרגשים עד 45 וולט. אותות המד נרשמים עם אוסצילוסקופ דיגיטלי בתדר MHz 1 כהיסטורית טעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתא על לחץ תא מבחנה מורכבת מבוכנת צילינדרים. הצילינדר יש קוטר 2.6 סנטימטר וסנטימטר קוטר פנימי 3.8 חיצוני, ויש לו חור קטן טפח בבסיס של החלל. החור משמש כאוויר ואוורור נוזלים עודף במהלך התקנת מדגם תא. הבוכנה ארוכה 7.5 סנטימטריםוהוא עשוי מאותו חומר בר. הבוכנה היא עטופה עם שתיים או שלוש שכבות של הקלטת של השרברב (טפלון), המשמשות כחותם חיכוך נמוך. הכובע הסופי הוא 32 מ&quot;מ ארוך ויש לו שני ברגי נירוסטה קטנות שמהדקים את coverslips הזכוכית (שבתאים בתרבית) במהלך הטעינה. </li></ol> 3. Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל החלקים הקאמריים pressurization מעוקרים באמצעות החיטוי ונשמרים תחת אור UV. ההרכבה של התא מתבצעת בתוך מכסה מנוע תרבית התאים. בורג האוורור בתא עוסק באופן רופף בפתח האוורור בבסיס של החלל. טרום התחמם (37 ° C) תקשורת צמיחה הטריה pipetted לתוך התא בלי בועות. ואז, שקופית זכוכית תא תרבותית היא הרים, וממוקמת על המכסה של הבוכנה (תאים פונים החוצה). הברגים שהחזיקו קטנים הדקו למטה על השקופית כדי להחזיקו במקום. הבוכנה עם שקופית זכוכית תא תרבותית מוכנסת מעט אניn בחלל של החדר, וההרכבה מוטה עם האוורור להיות בנקודה הגבוהה ביותר. בורג האוורור מוסר והבוכנה דחפה לתוך החלל מאלץ את הראשון בועות אוויר, ואז נוזלים העודפים. כך או סימון הפניה או לנענע משמש כמדריך על מנת להבטיח את אותו נפח תקשורת התרבות לכל מבחן. הממד הצירי של התקשורת בחדר הוא כ 6 מ&quot;מ. לטהר את בורג האוורור ולהחליף אותו כדי להפוך את המים הקאמריים הדוק. הקאמרי לא צריך לדלוף תחת עומס סטטי זו, אם כן, הטפלון לעטוף צריך להיות מוחלף או מחוזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, מערכת בר Kolsky מתאפסת. המסה הכבדה תועבר חזרה למיקום המקורי ובורג נעילה חדשה מחליף את שימוש (שבור). לעסוק בורג הנעילה החדש עם הידראוליקה לכ 200 psi. השתמש במספרי השקע כדי לדחוס את חלק הטעינה מראש של בר האירוע ללחץ קצת יותר גבוה מהערך הרצוי, ולאחר מכן לגבות אותו לעסוק חיכוך מלאבורגו של ג&#39;ק. רכישת הנתונים כעת חמושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקאמרי pressurization התא התאסף הוא רכוב לתוך המערכת. הוא ממוקם בבלוק V הנתמך על ידי מעבדת שקע מספריים קטן ומיושר עם שני הפסים. משמנים כל ממשק עם שכבת גריז אור ולשפשף את המשטחים הנדחפים יחד כדי לחסל את כל מרווחי אוויר שביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבחן עכשיו הוא מוכן להמשיך. בורג נעילת המהדק הוא נאלץ לשבור על ידי שאיבת נהג המהדק ההידראולי במהירות. המהדק יפריד ורכישת הנתונים צריכה להציג את התוצאות. היסטורית pressurization התא נקבעה מהמדידות של המד הבר המשודר. אם הבר מועבר משמש הוא מספיק זמן, זה אמור להיות רק מההפרעה הראשונה שהנקודה שבה המדידות מראות לחץ שלילי. משך הדופק מועבר עשוי להיות קצר יותר מדופק האירוע אם בועה היא לכוד. הגודל לא יכול להגיע לזה של דופק האירוע, אבל זה צריך להיות מספיק לוןגרם מישור לפני הפריקה. אחרת, או בועת אוויר גדולה בתא האטום או חוסר תיאום בין ההרכבה וברה אולי התרחשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז קאמרי pressurization התא מוסר ומפורק בתוך ברדס תרבות התא. בורג האוורור מוסר והבוכנה נחלצה מהתא. שקופית זכוכית תא התרבותית נלקחת מהקצה של הבוכנה. </li></ol> 4. הערכת התנהגות תא לחץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר על לחץ, התאים ניתן יהיו לבדוק באופן מיידי או מודגרות נוסף לבדיקה מאוחר יותר. עם תהליכי תפעול אספטיים נאותים, לטווח ארוך לאחר הדגירה אפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי לחץ יכולים לבדוק את כל טכניקות הביולוגיה המולקולריות ותאיות. באופן ספציפי לתא על לחץ עצבי, כדי לחקור את הפיסיולוגיה התאית ומולקולרית בתנאי TBI, מבחני הערכת שינויים בלחץ מושרה בתולדת neurite, שינוי microtubule cytoskeletal, expre גן העצביssion, אפופטוזיס, וכו &#39;, ניתן לבצע. כדגימות בקרה סלולרית, תאים שהם בתרבית באותו זמן, בתוך חדר pressurization לאותה תקופת זמן, אבל לא בלחץ משמשים (מה שנקרא, חדר בקרה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת השינויים בתולדת neurite, תאי בקרת לחץ וקאמריים נבחנים על ידי מיקרוסקופ אופטי מייד לאחר pressurization וh 1 ו 24 שלאחר הדגירה. דוגמה לתמונות תא עצביות מוצגת בחלק &#39;נציג התוצאות&#39; (איור 2). שינוי האורך neurite ניתן לכמת מכתים immunofluorescent יקטין וניתוח תמונה. תאים קבועים עם 4% פתרון w / v paraformaldehyde, נשטף עם 0.05% חיץ v / v Tween-20 רחצה, וpermeabilized עם 0.1% X-100 פתרון v / v טריטון. לאחר חסימה עם 1% פתרון w / v שור אלבומין, תאים מודגרת עם isothiocyanate tetramethylrhodamine (TRITC)-מצומדות phalloidin. תמונות Immunofluorescent של התאים נלקחות באמצעות ניאוןמיקרוסקופ ואורכי neurites לתאים דחוסים ובקרה לכמת באמצעות ImageJ התוכנה (NIH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את neurites יכול להיות מזוהה כאקסונים או דנדריטים. על מנת להעריך את השינויים מורפולוגיים באקסונים או דנדריטים, הניסויים שתוארו לעיל ניתן לחזור באמצעות נוגדני גילוי כל מבנה, כלומר, neurofilament נוגדן (NF) לאקסונים וחלבון נוגדני microtubule המשויך (MAP2) לדנדריטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtubules הוא אחד ממרכיבי המפתח של cytoskeletal נוירונים, והניזק לmicrotubules שמש כסמן של פגיעה עצבית. 2 microtubule ניתן דמיין immunofluorescently באמצעות נוגדני β-טובולין. תאים הם קבועים לאחר שעות 0 ו 24 של פוסט על לחץ, מוכתמים בנוגדן β-טובולין, ונצפו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ההשפעה על לחץ אימפולסיבית על ביטוי גנים עצבי ואפופטוטיים, הסך RNA מופק מתאי לחץ ושליטה. Genביטוי דואר ניתן לבדוק על ידי ביצוע כמותית RT-PCR או בזמן אמת RT-PCR, בדומה לפרוטוקולים שפורסמו. 3 </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. דוגמה של פרופיל לחץ מוחל על התאים בתוך תא לחץ הקבוע. מנגנון בר Kolsky יוצר הצלחת רמת מגפ&quot;ס 2, pressurization אימפולסיבית הסוג יחיד דופק עם משך זמן של כ -0.7 אלפיות שני. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. דוגמה של תגובה עצבית לתא על לחץ אימפולסיבית. תאי SH-SY5Y חשוף ללחץ קבוע אימפולסיבית בהתמוטטות 2 מגפ&quot;ס תכנית ברורה neurite / האקסון יחסית לתאי בקרה קאמרית. 6. קשיים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכת איטום הוא אחד המכשולים העיקריים שיש להתגבר עליהם. זה foאונד שדיסקים רחבים עם o-טבעות יש לך בעיה של ניקור וחיכוך מוגבר. על מנת להסיר את השפעות החיכוך, כמו גם למנוע ניקור, שיטה פשוטה של ​​מקליטת בוכנה עם הקלטת של שרברב הטפלון משמש. זה פותר את הבעיות ומייצר רמה ומשך לחץ רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנהגות תא לחץ עצבית, במיוחד כשבוחן את מנגנון TBI משני או השפעות לטווח ארוך יותר, יש לבחון לאחר זמן רב לאחר דגירה. תא תא המכיל חשוף לפוטנציאל לא סטרילי תנאים תוך מעבר לבר Kolsky, pressurizing, ועל חזרה למכסת מנוע תרבית התאים. עם עיקור מראש של חלקים הקאמריים ותפעול תקין בהרכבה / פירוק של שקופית תא התרבותי ותא בתוך מכסה מנוע תרבית התאים, בטווח ארוך יותר לאחר הדגירה אפשרית עד מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השחזור של הנתונים הוא פרמטר חשוב בניסויי גירוי מכאניים סלולריים. למכשיר שלנו, reproducibility בתגובת תאים עצביות נקבע כיצד רצוי פרופיל pressurization אימפולסיבית, היא ברמת לחץ ומשך, מתקבל שוב ושוב. מכיוון שאנו להקליט את פרופיל הלחץ התקבל לכל על לחץ, את הנתונים מפרופיל תגובת תא לחץ לא רצוי ניתן לשלול באופן ידני לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים השלמים pressurization, כולל קאמרית הרכבה, העברה ולעלות בKolsky הבר, על לחץ, העברת גב, וקאמרי פירוק, לוקחים פחות מ 10 דקות. השקופית תרבותי התא הבאה ניתן בלחץ מייד לאחר pressurization הקודם. לפיכך, מספר מספיק של ניסויי pressurization ניתן להשלים ביעילות. ההגדרה שלנו מנצלת 18 coverslips זכוכית בקוטר מ&quot;מ. ניסוי pressurization אחד לא מספק מספיק חלבונים למערב immunoblotting בשל גודל מצע (וגם בין שאר משום שחלק מתאי הלחץ הם מת). שלושה ניסויים חוזרים ונשנים אודות pressurization לספק כמות חלבון הדרושה לimmunoblotting. שוב, השחזור נבדק כל זמן עם פרופיל הלחץ. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

רבים בטכניקות מבחנה ניסיונית כבר ניסינו לחקר ניזק לתאי מוח בתנאי TBI. אלה כוללים נוירון / מתיחת זרימה מושרה מתח astrocyte, גזירה, ירידה במשקל, חתך חרט, ליזר חיתוך רוחב, lithotripsy, וכו &#39;4,5 זה כבר להניח שoverpressure בזמן קצר הוא גורם פיזי דומיננטי לTBI. 6,7 במיוחד , שוקווייב של פיצוץ TBI יש משך פעימה של סדר אלפיות שניים. 4 מבוססים על הנחה ותצפית זו, קאמרית הברומטר מסוגל pressurization החולף פותח ומשמש להערכת התנהגות תא מוח בתנאי TBI. לדוגמה, בהקשת barotrauma הקאמרי נוזל דופק לחץ עם משך 20-30 אלפיות ארוכים ולחץ שיא של עד 0.5 מגפ&quot;ס שבו בודק את התנהגות תא גלייה האנושית תחת TBI. 6 לאחרונה, VandeVord et al. 7 מתכת המשמשת קאמרי הברומטר כדור הפוגע לבחון את תא astrocyteהתנהגות תחת TBI אבל כדור המתכת בולטת פיק פולסים לחץ מרובים. במחקר זה, פתח מכשיר סלולרי על לחץ שיוצר רומן pressurization אימפולסיבית הסוג יחיד דופק. המכשיר פותח על בסיס הגדרת בר Kolsky, אשר שמש כמנגנון בדיקת חומר ב8 והשני של המחקרים שלנו. 1,9 יכולת בדיקת החומר של Kolsky הבר בקצב טעינה גבוה מאוד שונתה כדי שתוכל תחול overpressure סוג היחיד דופק לתאים בתרבית בתוך תא לחץ הקבוע (איור 1). אנחנו יכולים לשלוט בהצלחה את העצמה ומשך overpressure אימפולסיבית. כתגובת תא נציג, הראינו כי ב2 תאי לחץ MPA SH-SY5Y עצביים להציג neurite משמעותי ואובדן אקסונלית בהשוואה לתאי בקרה קאמרי ללא לחץ. לסיכום, אנו פתחנו מנגנון רומן אימפולסיבי תא לחץ קבוע באמצעות Kolsky תוכנן במיוחדמכשיר בר והפגין שימוש הפוטנציאל שלו בחקירת תגובת תא עצבית בתנאי TBI. אנחנו גם לציין כי טכניקה זו היא מאוד תכליתית שביכול להיות חשוף לכל סוג של תאים ללחצים אימפולסיביות ברמה ומשך שונים. לכן, מכשיר יכול לשמש כדי לחקור את ההתנהגות אימפולסיבית mechanotransduction הסלולרית לחץ המושרית, לא רק לפגיעה בתאים, אלא גם להמרצת התאים חיוביים בתפקודם ונחישות גורל.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) תאי neuroblastoma אדם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 18 coverslips זכוכית בקוטר מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת סלולרית תרבות: DMEM, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין סטרפטומיצין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצה רטינואית (10 מיקרומטר) לneurogenesis התרמה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר pressurization אימפולסיבית Kolsky בר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קאמרי pressurization תא בוכנת צילינדרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגי נירוסטה לאבטחת coverslip התרבותי תא על הבוכנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גריז לממשקים בין תא התא וKolsky הבר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אספקת ביולוגיה מולקולרית כללית להערכת תגובת תא לpressurization (מקבע, נוגדנים, צבע זרחני, אספקת PCR, וכו &#39;) </li></ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

ניסוי pressurization רומן אימפולסיבי תא פותח באמצעות מכשיר בר Kolsky לחקור פגיעה מוחית טראומטית פיצוץ מושרה (TBI). אנו מראים במאמר זה וידאו איך pressurization אימפולסיבית TBI-רלוונטי הפיצוץ מוחל על תאי העצב במבחנה. זו מושגת על ידי שימוש בדופק לחץ מבוקר היטב שנוצר על ידי מכשיר בר Kolsky מיוחד, עם היסטוריה של לחץ מלאה בתוך התא על לחץ התא המוקלט. תאים עצביים לחץ נבדקים מייד לאחר pressurization, או יותר מודגרות לבחון את ההשפעות ארוכות הטווח של לחץ קבוע על אימפולסיבית תולדה neurite / אקסונלית, ביטוי גנים עצבי, אפופטוזיס, וכו &#39;אנחנו נצפינו שpressurization אימפולסיבית בסביבות 2 מגפ&quot;ס גורם יחסי אובדן neurite מובחן לתאים ללא לחץ. הטכניקה שלנו מספקת שיטה חדשה לחקור את המנגנונים מולקולריים / סלולריים של פיצוץ TBI, דרך pressurization אימפולסיבית של תאי מוח ביחסי הציבור מבוקרים היטבessure עצמה ומשך זמן.

Watch this Scientific Journal Video about Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study at JoVE.com

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

ניסוי pressurization רומן אימפולסיבי תא פותח באמצעות מכשיר בר Kolsky לחקור את המנגנונים מולקולריים / סלולריים של פגיעה בפיצוץ גרם מוח הטראומתית.

Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים לחקר פגיעה מוחית טראומטי

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  University of Nebraska-Lincoln. ניסוי pressurization רומן אימפולסיבי תא פותח באמצעות מכשיר בר Kolsky לחקור את המנגנונים מולקולריים / סלולריים של פגיעה בפיצוץ גרם מוח הטראומתית.

Video: Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

הכשרת אנשים עם פגיעה בחוט השדרה כדי ambulate שימוש שלד חיצוני פועל

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

פילוח סיבים עצביים ספינלי לטיפול גירוי מוחי עמוק באמצעות דגמים אינטראקטיביים, מטופל ספציפי

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

חומצה היאלורונית מבוסס Hydrogels לתרבות תלת-ממדי של החולה-Derived גליובלסטומה תאים

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Mouse Model of Pressure Ulcers After Spinal Cord Injury

Pressure ulcers (PUs) are common debilitating complications of traumatic spinal cord injury (SCI) and tend to occur in soft tissues around bony prominences. There is, however, little known about the impact of SCI on skin wound healing in the context of animal models in controlled experimental settings. In this study, a simple, non-invasive, reproducible and clinically relevant mouse model of PUs in the context of complete SCI is presented. Adult male mice (Balb/c, 10 weeks old) were shaved and depilated. Post-depilation (24 h), mice were subjected to laminectomy followed by complete spinal cord transection (T9-T10 vertebrae). Immediately after, a skin fold on the back of the mice was lifted and sandwiched between two magnetic discs held in place for next 12 h, thus creating an ischemic area that developed into a PU over the following days. The wounded areas demonstrated tissue edema and epidermal disappearance by day 3 post-magnet application. PUs spontaneously developed and healed. Healing was, however, slower in the SCI mice compared to control non-SCI mice when the wound was created below the level of SCI. Conversely, no difference in healing was seen between SCI and control non-SCI mice when the wound was created above the level of SCI. This model is a potentially useful tool to study the dynamics of skin PU development and healing after SCI, as well as to test therapeutic approaches that may help heal such wounds.

Here, we describe a simple method to induce clinically relevant skin pressure ulcers (PUs) in a mouse model of spinal cord injury (SCI). This model can be used in pre-clinical studies to screen for different therapeutics for healing PUs in SCI patients.