עבודה זו נתמכת על ידי סיוע ייצור עבור טיפולים נייד (חוזה NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), במרכזים מיוחדים לטיפול סלולריים מבוססי גרנט NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), ASBMT פרס החוקר הצעיר (UG ו JV), עמית לוקמיה ולימפומה החברה מיוחדים פרס המחקר הקליני (UG), ו Strelzer איימי פרס Manasevit Scholar (AML).

1. DC nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מונוציטים הנגזרות קציר DCs, אשר היו מועשר באמצעות דבקות פלסטיק, בתרבית במשך 5 ימים באמצעות Cell Genix מדיה בתוספת IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) ו התבגר נוספת 24hrs באמצעות ציטוקינים התבגרות DC IL4 (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml ו PGE2 (1μg/ml) 1, על ידי resuspension עדין עם טפטפת העברת 3ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן DCs קיימא באמצעות trypan כחול, העברה לתוך צינורות 15ml 3x עם לא פחות מ 0.5x10 6 ולא יותר מ 2x10 6 תאים / צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה DCs עבור 10mins @ 200 גרם. במהלך הזמן הזה מראש חם Cell Genix התקשורת השלים עם ציטוקינים התבגרות DC (DC התקשורת התבגרות) - 2ml/well בשלוש בארות התרבות 12-באר רקמות שטופלו צלחת 37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שסיימת תאים ספינינג, לשאוב supernatant ולהוסיף את פלסמידים DNA רלוונטי לכל אחד הצינורות בריכוז סופי של ה-DNA צינור 5μg /. במקרה זה להוסיף את הקידוד פלסמיד IE1-pp65 לצינור מס &#39;1, Hexon-פנטון על צינור מס&#39; 2, ו-EBNA1 LMP2-BZLF1 אל צינור # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend DCs ו-DNA עם 100μl של פתרון nucloefection Amaxa, מערבבים היטב ומעבירים את cuvettes nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cuvettes מקום nucleofector 4D, לבחור תוכנית CB150 (Amaxa / Lonza), ולחץ להתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר nucleofection להוסיף 500μl של 2ml מראש חימם Cell Genix DC התקשורת התבגרות כדי קובט, מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים, DCs nucleofected להעביר לצלחת 12 גם מוכן המכיל את הנותרים 1.5 מ&quot;ל של prewarmed DC התקשורת התבגרות. העברה של 37 ° C / 5% CO 2 חממה נוספת 12-18hrs. </li></ol> 2. גירוי תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ולספור DCs nucleofected ו מקרינים על 30Gy. לשטוף פעם אחת עם 10 מ&quot;ל של מדיום CTL (45% RPMI, קליקים EHAA 45%, 10% FBS, 2mm Glutamax) ו resuspend @ 3 x 10 5 DCs לכל מ&quot;ל של התקשורת CTL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת מינימום של 7.5x10 5 (2.5ml) ועד למקסימום של 15x10 5 (5 מ&quot;ל) של DCs המכילות כל אחת פלסמידים ולהעביר את DCs נקווה למכשיר ה-G-Rex, אשר לאחר מכן ניתן יהיה להציב בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת תאים המגיב להשתמש גם PBMCs קפוא בעבר או לא חסיד mononuclear התאים שנותרו לאחר הבחירה DC ​​(או דבקות CD14 מבחר). להפשיר את התאים, להעביר בינוני תרבות prewarmed, לשטוף פעם עם התקשורת CTL. Resuspend התאים מדיה CTL, לספור את התאים ולהביא אותם בריכוז של 2x10 6 תאים לכל מיליליטר. קח 15x10 6 תאים או 7.5ml ולהשלים עם 30000U IL4 (1000U/ml -. קונצרט כלשהו סופי) ו 300ng IL7 (10ng/ml - קונצרט כלשהו הסופי.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 7.5ml של PBMC (15x10 6 תאים) ל-G-רקס למעלה למעלה bioreactor עם התקשורת CTL כדי בהיקף כולל של 30 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ה-G-Rex במשך 6-7 ימים 37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור humidified. </li></ol> 3. T הרחבת התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 6-7, 10 מ&quot;ל לשאוב התקשורת, ואז לערבב את התאים הנותרים 20ml של התקשורת עם פיפטה 10 מ&quot;ל ו לספור תאים קיימא באמצעות trypan כחול. אם יש &lt;50x10 6 לחדש עם התקשורת + ציטוקינים טריים. אם יש&gt; 50x10 6 תאים להסיר 10ml ההשעיה התא, העברה חדשה G-Rex, ולאחר מכן להאכיל גם G-Rexs עם התקשורת CTL + ציטוקינים טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות 4-6 ימים נוספים. לאחר מספיק תאים הורחבו, לבצע אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של עודף CTL ו cryopreserve לשימוש עתידי. </li></ol> 4. נציג תוצאות: סכמטי של תהליך ה-FDA multivirus הספציפי שלנו דור CTL מוצג באיור 1. בניגוד לאמנה פרוטוקולים multivirus CTL אשר השימוש adenovectors EBV ו-LCL לעורר וירוס-reactive בתאי T 2 יש לנו להחליף חומר וירוס מדבק עם פלסמידים DNA המקודדים אנטיגנים רבים שמקורם בכל אחת וירוסים 3. כדי לעורר CTL trivirus עיצבנו three multicistronic פלסמידים קידוד Hexon ו פנטון של adenovirus, IE1 ו pp65 של CMV, ו EBNA1, LMP2 ו BZLF1 של EBV. אנטיגנים אלה נבחרו בהתבסס על תוצאות מעודדות הקליניים של שלנו ושל קבוצות אחרות מראים כי תאי T המכוונים נגד עו&quot;ד hexon ו-פנטון 2,4-6, וכדי CMV-1E1 ו CMV-pp65 הם המגן in vivo 7. עבור EBV, EBNA1 היא מסוג CD4 + immunodominant היעד תא T אנטיגן לידי ביטוי בכל EBV הקשורים ממאירות וכן EBV נגועים בתאים נורמליים B 8,9, LMP2 הוא immunogenic בין סוגי HLA מרובים לידי ביטוי ממאירות EBV ביותר, בעוד 10,11 BZLF1 מקודד immunodominant, אנטיגן מיידית מוקדם במחזור ממס מגרה הן מסוג CD4 + ו - CD8 + T תאים מרוב יחידים חשוב סביר לדוntrol של תאים שכפול הנגיף 12. כדי להמשיך לייעל את שיטות הייצור שלנו אנו פעולה עם טכנולוגיה הטבע שיצר minimalized, ללא אנטיביוטיקה (FDA תואמי) פלסמידים לגירוי CTL 13,14. באמצעות אסטרטגיה זו אנו בעקביות להשיג יעילות של 35% nucleofection&gt; תוך שמירה על כדאיות התא גבוה (מידע לא מוצג) 3. איור 2 מראה כי שכיחותה של וירוס ספציפי בתאי T בתגובה פלסמידים DNA אופטימיזציה כפי שנמדד על ידי IFNγ ELIspot, היה גדול יותר מ בתגובה pShuttle מבוססי פלסמידים קונבנציונאלי ביטוי המבטא את אנטיגנים זהה (n = 8 adenovirus, n = 4 CMV, ו n = 2 EBV). יחס אופטימלי של DC: PBMC היה חשוב גירוי חזק תא T כפי שמוצג באיור 3 שם יחס של 1:50 המיוצר תת אופטימלית ההפעלה לעומת 1:20 S: יחס R (n = 2 תורמים). הפקה של מספרים CTL מספיק עם סגוליות אנטיגן רחב הוא תנאי מוקדם עבור יעילות קלינית כנגד כל שלושת וירוסים. זו מושגת על ידי תרבות CTL ב-G-Rex, התומך תא מעולה הרחבה T לעומת 24 גם צלחות קונבנציונאלי (איור 4 א) 15, תוך תוספת של IL4 ו IL7 לעליות תרבויות הרפרטואר וספציפיות כפי שמוצג באיור 4B איפה את תדירות בתאי T תגובתי נגד CMV-pp65-derived HLA-A2 resticted NLV פפטיד הוערך בתרבויות שנוצר נוכחות או היעדר של IL4 ו / או IL7 16,17. כדי להעריך את היכולת פנוטיפ תפקודית של תאים מורחבת אנו מבצעים ניתוח תזרים cytometric, תאיים מכתים / IFNγ ציטוקינים ELIspot, Cr ו - 51 מבחני שחרור על המוצר הסופי עבור cryopreservation / חליטה. בדרך כלל התאים שנוצרו הם polyclonal עם אוכלוסייה מעורבת של CD4 + ו - CD8 + T תאים עם סגוליות-אנטיגן להבחין בשני תאים תא T. CTL מסוגלים להרוג אנטיגן נגיפי לבטא בתאי המטרה, אך לא וירוס שלילית חלקית HLA יעדים מתאימים, המציין כי הם לא צריכים לגרום השתל נגד מארח מחלה (GVHD) in vivo (איור 5). <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. בפרוטוקול rCTL ​​דור. ראשית, הם DCs nucleofected עם אנטיגן קידוד פלסמידים ויראלי ולאחר מכן מעורבב עם PBMCs עצמיים ב-R: S של 10 או 20:01. תאים הם התרחבו ב-G-Rex במשך 10-14 ימים בנוכחות IL4 ו IL7, שנקטפו אז, נספר, נבדק על זהות פונקציה, עקרות, וגם אז cryopreserved לשימוש קליני. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. פלסמידים DNA אופטימליים לגרום לתא מעולה הפעלה T במבחנה. DCs היו nucleofected עם אופטימיזציה, ה-FDA תואמי פלסמידים קידוד Hexon ו פנטון (עו&quot;ד), ו IE1 pp65 (CMV), ו EBNA1, LMP2 ו BZLF1 (EBV) או פלסמידים pShuttle קונבנציונאלי קידוד אנטיגנים אותו. אלה שימשו כדי לעורר בתאי T וספציפיות נותח על ידי ELIspot IFNγ 10 ימים לאחר גירוי. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3 DC אופטימלית:. יחס תא T להפעלת CTL. DCs מ 2 התורמים היו nucleofected עם כל שלושת פלסמידים מותאם ולאחר מכן השתמשו כדי לעורר PBMCs עצמיים בשעה 1:20 או 1:50 DC: יחס PBMC. תדירות של תאים T מחדש הוערכה על 10 יום על ידי IFNγ ELIspot. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. התרחבות T תא ה-G-Rex באמצעות ציטוקינים שיפור. לוח מראה את מכשיר ה-G-רקס, כמו גם המראה CTL על קרום חדיר גז, מוערך על ידי מיקרוסקופית. השוואה בין התפוקה תא להשיג בתרבית רקמה כנס מטופלים צלחות vs G-Rex מוצג גם. לוח ב &#39;מראה את התדר של CTL pentamer CMV חיובית מושגת בתרבויות מורחב בנוכחות ציטוקינים לא, IL4 לבד, לבד IL7 IL4 + IL7. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. הפנוטיפ והתפקוד של CTL מורחבת. לוח מראה דוגמה מייצגת של הפנוטיפ של CTL multivirus מורחבת, אשר polyclonal בתערובת של CD4 + (45% - עוזר) ו - CD8 + (42% - ציטוטוקסיות) ותאי T, אשר רובם (95%) הביעו את זיכרון סמן CD45RO + / CD62L +. לוח ב &#39;מראה כי תאים אלה הם ספציפיים לכל האנטיגנים מגרה והם polyfunctional כפי שהוערכו על ידי מכתים ציטוקינים תאיים לאתר הייצור של IFNΓ ו TNFα לאחר גירוי אנטיגן. לוח C מראה כי CTL מורחבת הם פונקציונליים, כפי שהיא נמדדת על ידי assay 51 Cr. LCL עצמיים, לבד או עם transduced וקטור ריק או וקטור adenoviral להביע CMV-pp65 שימשו זפתמקבל. Alloreactivity הוערכה באמצעות allogeneic תקיעות PHA כמטרה.

<ol>
	<li>Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+producing+capacity+as+markers+of+function:+a+cautionary+tale.">Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale.</a> J Immunother. 31, 359-369 (2008).</li><li>Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals.">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).</li><li>Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+DCs+to+generate+Multivirus-specific+T+cells+for+prevention+or+treatment+of+viral+infections+in+the+immunocompromised+host.">Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host.</a> Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).</li><li>Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hexon-specific+CD4+and+CD8+T-cell+epitopes+for+vaccine+and+immunotherapy.">Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy.</a> J Virol. 82, 546-554 (2008).</li><li>Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocyte+therapy+with+donor+T+cells+prevents+and+treats+adenovirus+and+Epstein-Barr+virus+infections+after+haploidentical+and+matched+unrelated+stem+cell+transplantation.">Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.</a> Blood. 114, 4283-4292 (2009).</li><li>Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+adoptive+transfer+of+virus-specific+T-cell+immunity+for+the+treatment+of+systemic+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).</li><li>Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+cytomegalovirus+after+transplantation+is+correlated+with+immediate+early+1-specific+CD8+T+cells.">Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells.</a> J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).</li><li>Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immunogenicity+of+Epstein-Barr+virus+latent-cycle+proteins+for+human+CD4(+)+T-helper+1+responses.">Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses.</a> J Virol. 75, 8649-8659 (2001).</li><li>Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBNA1-specific+CD4++T+cells+in+healthy+carriers+of+Epstein-Barr+virus+are+primarily+Th1+in+function.">EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function.</a> J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).</li><li>Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+latent+membrane+protein+2+specificity+in+CTL+lines+from+patients+with+EBV-positive+nasopharyngeal+carcinoma+and+lymphoma.">Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma.</a> J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).</li><li>Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+responses+to+viral+infection+in+humans:+lessons+from+Epstein-Barr+virus.">Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).</li><li>Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+early+and+early+lytic+cycle+proteins+are+frequent+targets+of+the+Epstein-Barr+virus-induced+cytotoxic+T+cell+response.">Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response.</a> J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).</li><li>Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+antibiotic-free+DNA+vaccine+vectors+utilizing+a+novel+RNA+based+plasmid+selection+system.">Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system.</a> Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).</li><li>Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pDNAVACCultra+vector+family:+high+throughput+intracellular+targeting+DNA+vaccine+plasmids.">pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids.</a> Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).</li><li>Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+production+of+antigen-specific+T-cells+for+pre-clinical+and+clinical+applications+using+Gas-permeable+Rapid+Expansion+cultureware+(G-Rex.">Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex.</a> Journal of Immunotherapy. , (2009).</li><li>Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+survival+of+activated+T+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).</li><li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+(IL-4)+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells:+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4.">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).</li><li>Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+restoration+of+immunity+against+Epstein-Barr+virus+infection+by+adoptive+transfer+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes.">Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes.</a> Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).</li><li>Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes+to+control+Epstein-Barr+virus-related+lymphoproliferation.">Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation.</a> Lancet. 345, 9-13 (1995).</li><li>Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+cytomegalovirus+(CMV)-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy.">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916-3922 (2002).</li><li>Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor.">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).</li></ol>

חואן פ ורה הוא יועץ ייצור וולף וילסון. מחברים אחרים אין גילויים רלוונטיים.

זיהומים נגיפיים להסביר תחלואה ותמותה משמעותי בחולים immunocompromised על ידי המחלה או הטיפול בה. לאחר HSCT, למשל, זיהומים הנגרמים על ידי herpesviruses מתמשך כגון EBV ו CMV, כמו גם על ידי וירוסים בדרכי הנשימה כגון וירוס סינסיציאלי הנשימה (RSV), ידועים היטב, בעוד את החשיבות של זיהומים הנגרמים על ידי עו&quot;ד, וירוס BK, אדם ההרפס (HHV) -6 יש יותר לאחרונה מוערך. בעוד הם סוכני תרופתי הטיפול הסטנדרטי לזיהומים מסוימים, יש להם רעילות משמעותית, ליצור גרסאות עמידים, אינם יעילים לעיתים קרובות. לעומת זאת, וירוס ספציפי T בתאים שמקורם בתאי גזע התורמים הוכיחו בטוח ויעיל למניעה וטיפול של זיהום או מחלה ויראלית של השתלת תא גזע hemopoietic (HSCT) הגדרת 2,5,6,18-21. עם זאת, יישום רחב יותר של חיסוני תא T הוא מוגבל בסופו של דבר את העלות והמורכבות, ואת הזמן הנדרש לייצור CTL. הרומן שלנו גישה מהירה ליצור multivirus CTL, המתואר בכתב היד הנוכחית, יש להגדיל באופן משמעותי את הכדאיות של טיפול ציטוטוקסיים לתא T עבור מחלות ויראליות, מה שמאפשר את האסטרטגיה להיות רמת הטיפול לארח את החיסון. השימוש DCs nucleofected פלסמיד כמו נגמ&quot;שים מאפשר הצגת אנטיגן על שניהם אני בכיתה ו-II MHC ללא תחרות מצד וקטורים ויראליים או למעשה מן אנטיגנים נגיפיים מרובים לידי ביטוי בתוך תא בודד מאז אוכלוסיות שונות DC מנוצלים עבור כל 3 פלסמיד. השימוש הישרדות IL-T 07/04 עליות שגשוג תאים, אשר בהתאם עוזר להגדיל את התדירות ואת הרפרטואר להגיב אנטיגן ספציפי בתאי T 16,17. לבסוף, תרבות ה-G-Rex מפחיתה באופן דרמטי את תא T אפופטוזיס במהלך התרבות. חילופי גז (O 2 ב ו - CO 2 מתוך) מתרחשת על פני קרום חדיר גז סיליקון בבסיס הבקבוק, מניעת היפוקסיה תוך מתן אפשרות יותר עומק של המדיום מעל התאים, לספק חומרים מזינים יותר דילול חומרי פסולת. פלטפורמה זו ניתן גם להרחיב וירוסים נוספים כאשר אנטיגנים מגן מזוהים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R + D מערכות </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> Peprotech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> האדם א.ב. בסרום </td><td> עמק ביו בע&quot;מ </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> משרת בחיל האוויר-1001B &amp; משרת בחיל האוויר-1001X </td></tr><tr><td> Nucleofection Kit </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP-3012 </td></tr><tr><td> פלסמידים </td><td> NTC </td><td> n / a </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> R &amp; D </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R &amp; D </td><td> LB-201-025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R &amp; D </td><td> 206-IL-CF </td></tr><tr><td> TNFα </td><td> R &amp; D </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> סיגמא </td><td> P6532-1mg </td></tr><tr><td> G-Rex </td><td> וילסון וולף ייצור </td><td> AY11-00027 </td></tr></tbody></table>

generation of multivirus-specific t cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant

זיהומים נגיפיים גורם התחלואה והתמותה ב allogeneic השתלת תא גזע hematopoietic (HSCT) לנמענים. אנו ואחרים יצרו בהצלחה חדורים T-תאים ספציפיים עבור אפשטיין בר וירוס (EBV), ציטומגלווירוס (CMV) ו adenovirus (עו&quot;ד) באמצעות ומונוציטים ו-EBV הפך לתא lymphoblastoid (EBV-LCL) גנים שונה עם וקטור adenovirus כמו הצגת אנטיגן תאים (נגמ&quot;שים). כמה כמו 2x10 5 / ק&quot;ג trivirus ספציפי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים (CTL) התרבו ידי יומני ספורים לאחר עירוי ונראה למנוע ולטפל במחלה ויראלית קשה אפילו עמידים לטיפולים זמינים אחרים. יישום רחב יותר של גישה זו מעודדת מוגבל על ידי עלויות ייצור גבוהות, המורכבות של ייצור זמן ממושך (4-6 שבועות לדור EBV-LCL, ו 4-8 שבועות לייצור CTL - סך הכל 10-14 שבועות) להכנה. כדי להתגבר על המגבלות האלה פיתחנו חדש, GMP תואם פרוטוקול ייצור CTL. ראשית, במקום adenovectors לעורר מתאי T אנו משתמשים תאים דנדריטים (DCS) nucleofected עם DNA פלסמידים קידוד LMP2, EBNA1 ו BZLF1 (EBV), Hexon ו פנטון (עו&quot;ד), ו pp65 ו IE1 (CMV) כמו הצגת אנטיגן תאים. נגמ&quot;שים אלה מחדש בתאי T ספציפיים עבור כל גירוי אנטיגנים. תרבות שנית, של הפעלת מתאי T בנוכחות של IL-4 (1000 U / ml) ו-IL-7 (10ng/ml) מגדילה ומקיים את הרפרטואר ותדירות שתאי T ספציפיים הקווים שלנו. שלישית, השתמשנו במכשיר חדש, גז תרבות חדיר (G-Rex) שמקדם את הרחבת והישרדות של מספרים גדולים לאחר גירוי תא יחיד, ובכך להסיר את הדרישה EBV-LCLS וצמצום התערבות טכנאי. על ידי יישום השינויים האלה אנחנו יכולים עכשיו לייצר CTL multispecific מיקוד EBV, CMV, ועו&quot;ד במחיר 10 דולר 6 תאים הוא מופחת על ידי 90%&gt;, וב רק 10 ימים ולא 10 שבועות באמצעות גישה זו ניתן להרחיב נוספים אנטיגנים נגיפיים מגן. גישת ה-FDA שלנו צריך להיות בעל ערך עבור יישומים מניעתי וטיפול בסיכון גבוה מקבלי allogeneic HSCT.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant at JoVE.com

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו&quot;ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

generation-multivirus-specific-t-cells-to-preventtreat-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K Views.  Baylor College of Medicine. פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו"ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.

Video: Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...