המחברים מבקשים להודות משתתפי מחקר והוריהם. אנחנו רוצים גם להודות לד&quot;ר Réjean לפוינט (צ&#39;אם נוטרדאם, מונטריאול, קנדה) לגישה לקורא ELISPOT, ד&quot;ר Lubo אלכסנדרוב לניתוח סטטיסטי, ודניס בלה, סנדרה קארון, סילבי ולואה ומרטין Caty למומחה טכני סיוע. נתמך על ידי מענקים ממבצע ד &#39;le Fonds לשפוך les projets דה המשוכלל ונדירות קליניק et d&#39;évalution des טכנולוגיות (CHU Sainte-Justine) לHS וPO, על ידי la Fondation מרכז דה Cancerologie צ&#39;ארלס-רונו, ועל ידי האגודה לוקמיה &amp; לימפומה של קנדה. ISF נתמכה על ידי מלגות מla Fondation CHU Sainte-ג&#39;סטין וle Fonds דה לה המשוכללת והנדירה du Québec-סנטה (FRQS). AJG היה זוכה במלגות מהמחלקה למיקרוביולוגיה, Infectiology ואימונולוגיה, אוניברסיטת מונטריאול (מלגת גבריאל-מרקיז), FRQS, והמכון הקנדי לבריאות המחקרesearch (CIHR). NM נתמכה על ידי la Fondation CHU Sainte-ג&#39;סטין, קרן קול, וFRQS.

פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי מועצת המנהלים המוסדית אתיקה סקירה של CHU Sainte-ג&#39;סטין, מונטריאול, קוויבק, קנדה, שבה נערך המחקר. הסכמה מדעת שבקשה וקיבלה מכל משתתפי המחקר, הוריהם או אפוטרופוסים חוקיים. כל ההליכים שבוצעו בימים 1 ו 2 חייבת להתבצע בתנאים סטריליים (כלומר תחת הזרימה למינרית). נהלי בטיחות סטנדרטיים לטיפול בדם אדם צריכים להקפיד. 1. ציפוי צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize difluoride polyvinylidene קרומים (PVDF) בחלק התחתון של 96 גם צלחות ELISPOT הלבן Multiscreen IP על ידי הוספה היטב כל אחד 20 μl של 35% אתנול דקות 1. ממברנות צריכה להיות מעט שקופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לשטוף את הבארות 3 פעמים עם 200 μl של בופר פוספט 1x (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 2 מ&quot;מ KH 2 PO 4, pH 7.4) באמצעות מולtichannel פיפטה או מכשיר דומה. שלב זה הוא קריטי בהתחשב בכך ששאריות אתנול יכולות להשפיע על כדאיות תא והקשירה של נוגדן ללכוד. צלחות ELISPOT הן שבירות וצריכים להיות מטופל בזהירות: השימוש במכונת כביסה צלחת אוטומטית אינו מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל הבארות עם 10 μl של נוגדן ללכוד IFN-γ אנטי אנושי בעכבר מטוהר בדילול מלא ב1x PBS לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. כסה את הצלחות עם ניילון נצמד רגיל ודגירת הלילה בשעה 4 ° C. </li></ol> 2. חסימת צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את הבארות, הקשה עליהם יבשים, ולשטוף צלחות 5 פעמים עם 200 μl של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הבארות עם 200 μl של מדיום RPMI 1640 מלא ודגירת צלחות לשעה 2 ב 37 ° C (חסימת צעד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את צלחות 5x עם 200 μl של 1x PBS ולשמור על הבארות מלאה של 1x PBS עד תאים מוכנים להיות מצופה. </li></ol> 3. נייד ציפוי וגירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן pתאי eripheral מונונוקלארים דם (PBMC) מדגימות דם ורידי אדם על ידי צנטריפוגה במילויי Ficoll-Paque באמצעות נהלים סטנדרטיים. לחלופין, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות, להפשיר aliquots של PBMC קפוא תחת חנקן נוזלי. לאחר צנטריפוגה, תאי resuspend האחרונים בריכוז סופי של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ו דגירה הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 באטמוספרת חממת מעיל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBMC מן החממה וresuspend אותם בנפח סופי של 5 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה PBMC בנוכחות 10 μl של endonuclease מהונדסת גנטי מmarcescens Serratia במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת aliquot 50 μl של PBMC ולערבב עם 50 μl של צבע הכחול trypan. ספירת תאים ולהעריך את הכדאיות% באמצעות haemocytometer ובדיקה מיקרוסקופית (שיטת הדרת צבע). שיטות אוטומטיות שונות לספירת תאים והערכה של אל פחית כדאיות תאכך לשמש. PBMC צריך להיות&gt; 95% קיימא. בטל מדגם כאשר הכדאיות נמוכה מ95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה PBMC ב700 XG במשך 5 דקות, supernatant קלפים שנזרקו, ותאי resuspend במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) בסרום מומת אנושי (שלו) בריכוז סופי של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. שמור על 37 ° C עד תערובות גירוי נוספות לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לבארות, טיפה אחת בכל פעם, מתערובת הגירוי המתאימה 100 μl. יש להשתמש בשלוש תערובות גירוי כמפורט להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני השימוש AIM-V בתוספת 2% (v / v) בסרום מומת אנושי (IHS) שליטה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנוגדן אנטי CD3 חד שבטי (OKT3 שיבוט) בדילול מלא במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר שליטה חיובית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אנטיגן VZV, בצורה של שני מוקרן γ (10,000 Gy; זמן חשיפת 30 דקות) לחיות חיסון VZV מוחלש (יחידות 1,350 פלאק ויוצרים [PFU] / מיליליטר) diluטד 1:200 במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS) או 1 מיקרוגרם של תערובת equimolar של 67 פפטידים (15 שאריות חומצת אמינו) המסונתזת המבוסס על הרצף של VZV מייד מוקדם (phosphoprotein IE63) . לשלוט ביעילות על ידי ניטור קרינת העדר סימנים גלויים של תופעות cytopathic לאחר 4 ימים בתרבויות PBMC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל הבארות בשני עותקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לבארות, טיפה אחת בכל פעם, של תאים מוכנים בשלב 5.4 לבארות המתאימות 100 μl. יש להשאיר שתי בארות ללא תאים (בקרה שלילית). דגירה של 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 באטמוספרת חממת מעיל מים. אין לטלטל, להעביר, או ערימת הצלחות על גבי זו במהלך דגירה. </li></ol> 4. ספוט פיתוח ואיתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את התאים ולשטוף את הצלחות 10x עם 1x PBS בתוספת 0.05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 מסייע לנתק את התאים שדבקו PVDFmbrane הבא דגירה הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 0.5 מ&quot;ג 100 μl / מיליליטר ביוטין מצומדות נוגדן חד שבטי אנטי IFN-γ (שיבוט 4S.B3) בדילול מלא ב1x PBS המכיל 0.5% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA). דגירה צלחות במשך שעה 2 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות 6x עם PBST ולהוסיף גם כל conjugatd streptavidin 100 μl עם phosphatase אלקליין בדילול 1:1,000 ב 1x PBS המכיל 0.5% (w / v) ארגון ה-BSA. כסה את הצלחות ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצלחות 3x עם PBST ו3x עם 1x PBS. הוספה של פוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl (BCIP) / פתרון מצע כלוריד tetrazolium הכחול (NBT) ניטרו 100 μl ודגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצלחות תחת זרם מים מזוקקים. הסר את החלק התחתון של צלחת ELISPOT ולשטוף את שני הצדדים של הקרום במים מזוקקים. אוויר יבש הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את הבארות ולמנות את הכתמים באמצעות ד סטריאוסקופיתמיקרוסקופ issection או לסרוק את הצלחות באמצעות דלפק מקום אוטומטי. שמור על הצלחות במרחק של אור אם הם לא יכולים להיבחן באותו היום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע המספרים של כתמים נספרו בבארות כפולות מקבילה ולהחסיר את מספר הנקודות נספרו בבארות בקרה השליליות (אין תאים) ממספר הנקודות נספרו בבארות הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביע את ייצור IFN-γ כמו מספר היחידות להרכיב-spot (אוניברסיטת סן פרנסיסקו) לכל 10 6 PBMC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בחשבון שדגימות הבדיקה הן חיוביות, אם המספר של אוניברסיטת סן פרנסיסקו הוא&gt; 50 ל10 PBMC 6 ו 2 סטיות תקן (SD) שמעל לפקד השלילי (בינוני + תאי AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשווי של 400 אוניברסיטה סן פרנסיסקו לכל גם כאשר כתמים רבים מכדי לספור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם נתוני ELISPOT מופצים בדרך כלל או לא באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב. כאשר נתונים בדרך כלל מופצים, לבצע השוואות סטטיסטיות באמצעות tes t של הסטודנטלא (2 קבוצות) או ניתוח שונה ולאחר בדיקת Bonferroni (השוואות מרובות). אם הנתונים אינם מתפלגים נורמלי, להשתמש במבחן מאן ויטני U (2 קבוצות) או במבחן קרוסקל-ארהב ולאחר המבחן של דאן (השוואות מרובות). </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שינויים ופתרון בעיות: מבחני IFN-γ ELISPOT שימשו כדי לבחון תגובות חיסונית בתיווך תא המכוון נגד מגוון רחב של חיידקים פתוגנים, כוללים סוג וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV-1) 24,25, וירוס הפטיטיס C (HCV) 26, 27, ושחפת Mycobacterium 28,29, רק כדי שם כמה. כאן אנו תיארתי את ההתפתחות ?...

בוצע לראשונה בשנת 1989, UCBT משמש יותר ויותר כחלק מהטיפול בהפרעות דם neoplastic וnonneoplastic שונות בילדים 1. VZV הוא alphaherpesvirus אדם cytopathic אשר גורם לשתי מחלות שונות, אבעבועות רוח (לאחר הדבקה ראשונית) והרפס זוסטר (לאחר הפעלה מחדש). בעקבות זיהום ראשוני, VZV נמשך לאורך כל חייו של המארח המוגן בתוך עצבי תחושה של גרעיני שורש הגבי. אחד הסיבוכים זיהומיות המאיימים ביותר הבאים UCBT קשור VZV 2-4. במרכז הקליני שלנו, בהעדר טיפול מונע VZV, ההיארעות המצטברת של מחלת VZV מחלה VZV לאחר 3 שנות postUCBT הייתה 46% 2. בחולים אלה, דה זיהום נובו עם או הפעלתו מחדש של VZV קשור לעתים קרובות עם הפצה קרביים למערכת העצבים המרכזית, ריאות וכבד 5-7. כטיפול מונע תוצאה מכך, acyclovir, valacyclovir או famciclovir מנוהל בדרך כלל UBמקבלי CT 8,9. עם זאת, אסטרטגיית טיפול זו אינה מביאה בחשבון את הפוטנציאל ההגנתי של לימפוציטים מסוג T או VZV ספציפי קינטיקה של הכינון מחדש של תגובות תא T הספציפיות VZV. בעיות פוטנציאליות הקשורים לשימוש המתרחב של טיפול מונע antiherpetic לטווח ארוך כוללות טיפול יתר) מטופל; ב) ההתפתחות של עמידות לתרופות אנטי 10,11; וג) ירידת ערך הכינון מחדש חיסוניים הספציפי VZV 12,13. בגלל זיהוי של לימפוציטים מסוג T הפונקציונלי VZV הספציפי בקורלציה עם הנוכחות של הגנה לטווח ארוך מפני זיהום VZV ותוצאה קלינית משופר 4,14,15, ניטור תגובות חיסוניים תא בתיווך המכוון נגד VZV במהלך התקופה לאחר ההשתלה עלול לגרום לשימוש מושכל יותר של נגיפים טיפול על ידי המאפשר רופאים כדי להבחין בין חולים שיפיקו תועלת מהטיפול מונע VZV מאלו שמערכת החיסון מסוגל לשלוט שכפול VZV 4,13. Assay ELISPOT γ-IFN נעשה שימוש נרחב לתגובות החיסונית בתיווך תא ניטור במגוון רחב של מערכות ניסיוניות ומצבים רפואיים. כתמים נוצרים בעקבות המחשוף של מצע chromogenic, שהניבו משקע נראה לעין ויציב באתר של התגובה. כל נקודה בודדת ובכך מייצגת את טביעת הרגל של תא לייצור ציטוקינים בודד. IFN-γ ELISPOT מודד לא רק את היכולת של תאים בודדים vivo לשעבר לייצר IFN-γ בתגובה לגירוי במבחנה עם אנטיגן מאותו המקור, אבל זה גם מספק הערכה של התדירות מגיב תאים באוכלוסיית תא נתון 16,17. בנוסף לרגישות הגבוהה שלו, IFN-γ ELISPOT הוא פשוט לביצוע, מה שהופך את השימוש בו אפשרי בהקשר של פרוטוקולים קליניים אישית שמטרה מנחה ייזום או הפסקה של טיפול אנטי. המפורטים להלן ההליך describes assay ELISPOT כי היא תוכננה במיוחד כדי לזהות ולמדוד את ייצור IFN-γ על ידי תאי הדם היקפיים mononuclear בעקבות גירוי במבחנה עם אנטיגנים VZV נגזרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

נגיף אבעבועות רוח זוסטר (VZV) הוא גורם משמעותי לתחלואה ותמותה לאחר השתלת דם טבורי (UCBT). מסיבה זו, טיפול מונע antiherpetic מנוהל באופן שיטתי לנמעני UCBT ילדים כדי למנוע סיבוכים הקשורים לזיהום VZV, אבל אין הסכמה שמגדירה את משך הזמן האופטימלי שלו חזקה, המבוסס על ראיות. בגלל חסינות תא בתיווך T היא אחראית על הבקרה של זיהום VZV, הערכה מחדש של תגובות תא T הספציפיות VZV הבא UCBT יכול לספק אינדיקציות באשר לשאלה האם יש לשמור טיפול מונע או יכול להיות שהופסק. לשם כך, assay אינטרפרון גמא הספציפי VZV (IFN-γ) Immunospot צמוד אנזים (ELISPOT) פותח כדי לאפיין ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים מסוג T בתגובה לגירוי במבחנה עם חיסון VZV מוקרן חי מוחלש. assay זה מספק מדידה מהירה, לשחזור ורגישה של ג הספציפי VZVell תיווך חסינות מתאימה לניטור הכינון מחדש של חסינות ספציפית VZV בסביבה קלינית והערכת תגובה חיסונית לאנטיגנים VZV.

פרוטוקול ELISPOT γ-IFN שפורט לעיל פותח ומותאם במעבדה שלנו כדי למדוד את הגודל והאיכות של תגובות תא בתיווך חיסונית המכוונות נגד VZV 4. מקורות שונים של אנטיגן VZV יכולים לשמש לשלב הגירוי. אלה כוללים: א) תמציות מומתים חומר ניקוי זמין מסחרי מVZV נגועים תאי Vero 18; ב) בריכות ח...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-Î³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV).

פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.5K Views.  Université de Montréal.  דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV). 

Video: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...