ברצוננו להודות אהרון Selya לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AI29575, CA108835, AI077097 ל JS, מענק טייס ג&#39;ונס הופקינס מלריה מכון המחקר ואת משרד ההגנה מענק PC 040,972 ל MO

1. ביצוע, HLA-A2-איג מבוסס aAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ borate סטרילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים חומצת בור מים כדי להפוך 0.1M. התאם את ה-pH ל 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון דרך המסנן בחנות סטרילי 0.22μm ובו 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף סטרילי חיץ ביד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 956ml PBS w / o מגנזיום או סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 מ&quot;ל האדם א.ב. בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף EDTA בריכוז 2mm הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.1gsodium אזיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון דרך פילטר סטרילי 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1ml של Invitrogen M-450 חרוזים אפוקסי מן המניות, כ -400 מיליון חרוזים (חרוזים ניתן לספור על ידי hemocytometer), ולשים לתוך צנצנת סטרילית, בראש הבורג זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הבקבוקון נגד מגנט Dynal MPC-1, בעוד החרוזים לדבוק בצד של הבקבוקון, להסיר את supernatant על ידי שאיפה. לשטוף חרוזים פעם עם 1ml של חיץ borate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend בתערובת של חיץ borate 1ml ו -20 מיקרוגרם של HLA-A2-איג דימר ו -20 מיקרוגרם של אנטי אנושי CD28 מב (Clone 9.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון הצמידה חרוז: לשים את בקבוקון זכוכית על הכתף וסיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורית מגנט MPC 1-ולהסיר את כל חיץ borate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים פעמיים עם חיץ ביד 1ml לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים במאגר 1ml לשטוף ביד, לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. בגלל החיץ לשטוף ביד האדם מכיל א.ב. בסרום, זה יהיה לחסום את כל האתר חלבון שיורית מחייבים החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מתוך בקבוקון זכוכית, להחליף עם חיץ לשטוף 1ml טרי ביד. </li></ol> 2. בקרת איכות של aAPC ו פפטיד טעינה, אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את ~ 5 × 10 5 חרוזים FACS 100μl כביסה חיץ צינורות FACS, ואת הכתם עם 1μl של אנטי עכבר IgG1-PE (מכירים את החלק Fc של HLA-A2-איג) ו 1μl של אנטי עכבר IgG2a-FITC (להכיר החלק Fc של אנטי CD28 מב). לאחר מכתים במשך 20 דקות ב FACS כביסה חיץ, לשטוף שוב לקרוא את התוצאה מכתים מיד cytometer זרימה (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת פפטיד על החרוזים: לשטוף את החרוזים פעמיים בקבוקון זכוכית עם 1ml סטרילי PBS. Resuspend עם 1ml סטרילי PBS ולאחר מכן להוסיף 10μl של CMV פפטיד (1mg/ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן חרוזים ידי hemocytometer, ואת התווית בקבוקון עם תאריך וריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> aAPC מוכנים לשימוש לאחר לפחות 3 ימים דגירה פפטיד ב 4 ° C, כדי לאפשר זמן מספיק מחייב פפטיד על דימר HLA-A2-איג. החרוזים ניתן לאחסן 4 ° C ולהישאר תפקודית למשך חודש לפחות 6. </li></ol> 3. בידוד האדם CTL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ~ 100 מ&quot;ל של דם היקפיים טרי מתורם HLA-A2 בריא חיובית לתוך 10 הפרין BD צינורות נתרן Vacutainer. שימוש במחט 21-מד או יותר כדי למנוע המוליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 300xg במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להסיר את השכבה העליונה פלזמה על ידי שאיפה. פלזמה יכולה לשמש תוספת עבור המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפלזמה שנאספו עם סטרילי PBS ולהעביר את הדם לתוך בקבוק סטרילי תרבות T75 או 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי. מערבבים את הדם עם PBS היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הדם נאסף, להכין וארבעה 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי ולהוסיף 15ml של פלוס Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט כיסוי 30-35ml של כדוריות דם על גבי Ficoll של צינור אחד. שמור ממשק ברורים בין Ficoll ותאי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 500xg במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הפעל את בלם &quot;כבוי&quot; ואת האצת נמוך ככל האפשר כדי לשמור על ממשק ברור בין השכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה seriological, לשאוב בזהירות את השכבה PBMC לאסוף את PBMC לתוך צינור חרוטי טרי 50 מ&quot;ל. כאשר PBMC כל נקצרים להוסיף 30 מ&quot;ל של PBS ו ספין על 400xg במשך 10 דקות. בטל supernatant לשטוף פעם נוספת עם 30 מ&quot;ל PBS כדי להסיר את כל Ficoll שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בידוד תא T CD8 + באמצעות Miltenyi האדם CD8 + T תא הבידוד בערכה על פי פרוטוקול של היצרן. ערכה זו מעשירה מאוד עבור CD8 + תאים (בדרך כלל&gt; 95%) על ידי depleting CD8 - תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן CD8 + T תאים. טוהר צפוי להיות יותר מ 95%. כדי לאשר להשתמש 2x10 5 תאים לבצע ניתוח CD4/3/8 FACS. CTL הנותרים ניתן להשתמש גם מיד לגירוי-אנטיגן ספציפי aAPC או שהם יכולים להיות קפוא לשימוש עתידי. </li></ol> 4. במערכת aAPC תרבות חוץ גופית מבוסס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור TF (צמיחה תא T גורם, שנעשו במעבדה 4) 2X תרבות בינוני: להשלים בינוני פלוס RPMI התורם 5% עצמיים פלזמה ו - 8% צמיחה T גורם התא. </li><li&gt; פלזמה התורם עצמיים ניתן להחליף על ידי החום האנושי מומת א.ב. בסרום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 1,000,000 CTL ב 8ml של המדיום 2X תרבות TF פלוס 8ml של המדיום RPMI להשלים, להוסיף 1 × 10 6 aAPC, ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipetter מרובת ערוצים לתאי צלחת על 96 גם רקמות U בתחתית צלחות תרבות. (160 μl לכל טוב) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תרבות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 incubater למשך 7 ימים. להאכיל את התאים ביום 4 עם 80 μl בינוני / טוב 2X TF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מוכנים שנקטפו ביום 7. לאחר הקטיף, המקום התאים כנגד המגנט ולהסיר את aAPC הישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגוליות Antigen ניתן לקבוע על ידי מכתים tetramer על פי פרוטוקול של היצרן. מכתים הפנוטיפ ואת מכתים ציטוקינים תאיים מבוצעות על פי 3 במחקר הקודם שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים נקצרו ניתן replated עם aAPC שוב באותם תנאים. מספר תאים סגוליות אנטיגן צפוי לגדול לאחר גירוי חוזר. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמה aAPC לאחר נטיה HLA-A2 איג אנטי CD28 מוצג באיור 4. נטיה חלבון מוצלח ניכר על ידי שינוי ברור של נוגדן מכתים המקביל. בעוד שכיחות CMV CTL הספציפיים בדם ההיקפי הוא בדרך כלל 0.5-1%, לאחר שבוע אחד של גירוי aAPC בתיווך, סגוליות יכול להגיע 55-93% (איור 2 ו -3). הרחבת CTL אנטיגן ספציפי יכול להיות משתנה מאוד בין תורמים שונים, אבל התוצאות הן לשחזור בתוך התורם זהה. על ידי ניפוח, התרחבות של תאים ספציפיים CMV ניתן אלפי לקפל לעומת רמות מבשר ישירות vivo לשעבר (מידע לא מוצג). מכתים ציטוקינים תאיים (איור 3) מראה כי אלה הם polyfunctional CTL מורחבת, ולא מותשים, לאחר תרבית תאים ממושכת התפשטות משמעותית. <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תרשים זרימה נציג של aAPC הרחבה vivo מבוסס לשעבר של CTL האדם חיסוני המאמצת ב allogeneic HSCT <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="איור 2"/> 2. איור נציג מכתים tetramer תוצאה של CTL CMV ספציפי שנוצר על ידי aAPC לאחר שבוע של תרבות <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. מכתים נציג תאיים ציטוקינים תוצאה של CTL CMV ספציפי שנוצר על ידי aAPC (סגוליות CMV היה 61%) <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. התוצאה מכתים נציג M-450 חרוזים אפוקסי לאחר נטיה חלבון מוכתם אנטי עכבר IgG1-PE ואנטי עכבר IgG2-FITC

<ol>
	<li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor.">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li><li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+transfer:+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy.">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li><li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li><li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+antigen-presenting+cells:+artificial+solution+for+real+diseases.">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מערכת aAPC אנו מתארים כאן היא מערכת יעילה להרחבת vivo לשעבר של CTL אדם נגד מגוון רחב של אנטיגנים. טיפול מיוחד צריך להילקח בכל הנוגע לאיכות נטיה חלבון ההפצה אפילו aAPC ו CTL בתרבות צלחת 96-היטב. בגישה זו הצלחנו להרחיב CTL במשך יותר מ 8 שבועות, במהלכו הרחבנו אנטיגן ספציפי CTL עד מיליון פי 4. היו שונים APC מערכות מלאכותיות ניצול שורות תאים או פלטפורמות אחרות acellular 5, אולם על פי הנתונים שפורסמו בכל מערכת יש פרופיל ייחודי בכל הקשור להרחבת וספציפיות לתמוך ביישומים שונים. חשוב לציין, כי איכות CTL חשובה כמו כמות, polyfunctionality של CMV-CTL ספציפי שנוצר על ידי המערכת שלנו צפויים להעניק יעילות מעולה אנטי ויראלית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Vacutainer צינור (מכיל הפרין) </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> האדם CD8 + T ערכת בידוד תא </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-450 אפוקסי </td><td> Invitrogen </td><td> 140.11 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-1 מגנט </td><td> Invitrogen </td><td> 120-01D </td></tr><tr><td> Ficoll Paque-Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RPMI בינוני 1640 </td><td> Gibco </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA-A2-איג דימר X </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> פלקון 96-ברור גם צלחת Microtest </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> עכברוש אנטי עכבר IgG2a-FITC </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> עיזים אנטי עכבר IgG1-PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> האדם בסרום סוג AB </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD8a-FITC </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD8a-APC </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי IFNγ-FITC </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי TNFα-PE </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

hla-ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human ctl

CTL עם תפקוד אופטימלי מפעיל ממלאים תפקידים קריטיים בתיווך הגנה מפני זיהומים וסרטן תאיים שונים. עם זאת, אנשים יכולים להפגין microenvironment החיסונית ואת מדכאים, בניגוד להפעלת CTL, תאים עצמיים שלהם בהצגת אנטיגן עשויה נוטים tolerize או anergize CTL אנטיגן ספציפי. כתוצאה מכך, אם כי עדיין בשלב ניסיוני, CTL מבוסס חיסוני המאמצת התפתח להיות טיפול מבטיח למספר מחלות שונות כגון סרטן וזיהומים וירוס. בניסויים הראשונים לשעבר vivo מורחבת CMV (ציטומגלווירוס) CTL הספציפיים שימשו לטיפול זיהום CMV ב immunocompromised allogeneic מח העצם להשתלה בחולים. אמנם מקובל להיות מסכני חיים viremia CMV בחולים אלו, אף אחד מהחולים שקיבלו מורחבת CTL לפתח מחלות הקשורות CMV, רומז החסינות נגד CMV הוא הוקם על ידי CTL הועבר adoptively 1. תוצאות מבטיחות גם נצפתה למלנומה וניתן להרחיב סוגים אחרים של סרטן 2. אמנם יש דרכים רבות לשעבר vivo לעורר ולהרחיב CTL אדם, גישות הנוכחי מוגבלים ע&quot;י המגבלות עלות וטכני. לדוגמה, תקן הזהב הנוכחי מבוסס על שימוש של DC עצמיים. זה דורש כל מטופל לתרום מספר משמעותי של לויקוציטים, והוא גם יקר מאוד מייגע. יתר על כן, אפיון מפורט במבחנה של DC מורחבת CTL גילה כי אלו לא טובים רק פונקציה מפעיל 3. כאן אנו מציגים שיטה היעילה ביותר מבוסס aAPC להרחבת vivo לשעבר של CTL CMV אדם ספציפי חיסוני המאמצת (איור 1). AAPC נעשו על ידי צימוד בגודל תא חרוזים מגנטיים עם דימר האדם HLA-A2-איג ואנטי CD28mAb 4. לאחר aAPC נעשים, הם יכולים להיות עמוסה פפטידים שונים של עניין, ולהישאר תפקודית במשך חודשים. בדו&quot;ח זה, aAPC עמוסות פפטיד דומיננטי מ-CMV, pp65 (NLVPMVATV). לאחר culturing מטוהרים האדם CD8 + CTL מתורם בריא עם aAPC במשך שבוע אחד, CMV CTL הספציפיים ניתן להגדיל באופן דרמטי סגוליות עד 98% (איור 2) ו - מוגבר פי יותר מ -10,000. אם יותר CMV-CTL ספציפיים נדרשים, להתרחבות נוספת יכולה להיות מושגת בקלות על ידי גירויים חוזרים עם aAPC. אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מראה תאים אלה מורחבת יש פנוטיפ זיכרון מפעיל, ולעשות כמויות משמעותיות של שני TNFα ו IFNγ (איור 3).

Watch this Scientific Journal Video about HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL at JoVE.com

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

שיטה חדשה DC עצמאית לזירוז והרחבה של אנטיגן ספציפי לערמונית בתאי T מתואר. HLA-A2 איג תאים מלאכותיים הצגת מבוסס Antigen (aAPC) נטענים עם HLA-A2 פפטידים מוגבלת ביעילות להרחיב CTL הספציפיות אנטיגן מגוונים. טכנולוגיה זו מחזיקה פוטנציאל גדול עבור חיסוני CTL מבוססי המאמצת.

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

hla-ig-based-artificial-antigen-presenting-cells-for-efficient-ex

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

15.3K Views.  Johns Hopkins University. שיטה חדשה DC עצמאית לזירוז והרחבה של אנטיגן ספציפי לערמונית בתאי T מתואר. HLA-A2 איג תאים מלאכותיים הצגת מבוסס Antigen (aAPC) נטענים עם HLA-A2 פפטידים מוגבלת ביעילות להרחיב CTL הספציפיות אנטיגן מגוונים. טכנולוגיה זו מחזיקה פוטנציאל גדול עבור חיסוני CTL מבוססי המאמצת.

Video: HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

אקס הרחבה vivo של גידול תאים T-reactive באמצעות 1/Ionomycin Bryostatin ואת גמא נפוצים שרשרת גיבוש ציטוקינים

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...