סי אלגנס transgenes סופקו על ידי גנטיקה Caenorhabditis מרכז (אוניברסיטת מינסוטה, במיניאפוליס, מינסוטה). עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 מענק NS0667678-01 ל KS. כל המחברים שהשתתפו באוסף, ניתוח ופרשנות של נתונים. CKL, KS, ו KPC השתתפו בכתב לתיקון כתב היד.

1. הכנת מזון תולעת חיידקי יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של E. רווי coli OP50 התרבות חיידקים ל -500 מ&quot;ל מרק נהדר בתוספת סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ&quot;ל ו - 50 לגדול חממה רועד (225 סל&quot;ד) לילה בשעה 37 ° C. </li></ol> יום 2 <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול התרבות חיידקים לילה לעשרה צינורות 50 מ&quot;ל חיידקים צנטריפוגות בצנטריפוגה בקירור ב RCF 2500 במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את המרק LB ו resuspend כל גלולה חיידקי 10 מ&quot;ל של נוזל צמיחה התקשורת נמטודות (NGM). Shake אופקית רצפה שייקר במשך 15 דקות כדי resuspend את החיידקים. כדי להפוך את המאגר NGM, להוסיף 3 גרם NaCl למים 1 L החיטוי deionized ו. מצננים 55 ° C ולהוסיף כדי הפתרונות סטרילי הבאים: 1 מ&quot;ל של 1 M CaCl 2, 1 מ&quot;ל של 1 M MgSO 4, 25 מ&quot;ל של M 1 פוספט אשלגן, 6.0 pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התרבות חיידקים בצנטריפוגה בקירור ב RCF 2500 במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את החיץ NGM ולשקול את גלולה חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של חיץ NGM כדי resuspend את כדורי, aliquot 3 מ&quot;ל של חיידקים להתרכז לתוך צינורות 15 מ&quot;ל, ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol> 2. בקנה מידה גדול C. elegans נוזלי תרבות אנו משתמשים בקו מהונדס VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST-4:: GFP: NLS)]; vsIs33 [DOP-3: RFP]) נושא שני מבנים ניאון: Pgst -4: 14-GFP כדי לפקח SKN-1 פעילות Pdop-3: 17 RFP לשמש תקן לנורמליזציה מספר התולעת. יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 150 מ&quot;ל NGM חיץ, 1.5 מ&quot;ל מרק LB, 150 μl של כולסטרול מ&quot;ג / 5 מ&quot;ל (ב אתנול), וכן 75 μl של סטרפטומיצין מ&quot;ג / 100 מ&quot;ל. מסנן לעקר את התערובת ולהוסיף בבקבוק סטרילי 1 ליטר. הערה: הוספת מרק LB 1% למאגר NGM מסייעת במניעת תולעים מן דבק זכוכית plasticware, אך סכום זה אינו מספיק כדי לתמוך בצמיחה חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנכרון עם תולעים ההליך hypochlorite תקן 18. עד 0.5 מ&quot;ל של תולעים הרה להולדת יכול להיות מעובד בצינור יחיד 15 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של תמיסת hypochlorite (3.75 מ&quot;ל מים סטריליים, 1 מ&quot;ל אקונומיקה הבית, 250 μl 10 N NaOH). לשטוף את הביצים שוחרר עם מים סטריליים resuspend אותם 10 מ&quot;ל של חיץ NGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל מדגם של 100 ביצים לקפל NGM חיץ (למשל, 100 מ&quot;ל ב μl 10), לספור את מספר ביצים בשלושה 5 aliquots נפרד μl. מספר ממוצע של 200,000 (100 גורם לדילול x 2000) כדי להעריך את המספר הכולל של ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200,000 ל -2 מיליון ביצים בקבוק עם חיץ NGM ולנער את התרבות בסל&quot;ד 100 ב 20 ° C. </li></ol> יום 2 <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות 16 שעות לאחר הוספת ביצים הבקבוק, השתמש pipet סרולוגיות סטרילי כדי להסיר כ 0.5 מ&quot;ל של התרבות תולעת תנאי. Three Pipet 5 טיפות μl על המכסה סטרילית של בצלחת פטרי. מניחים את המכסה ב -20 ° C במקפיא במשך 1-2 דקות כדי לשתק את התולעים. הרוזן המספר הממוצע של תולעים בקעו חיים לכל 5 μl ולאחר מכן על ידי מספר 30000 (150 מ&quot;ל / 5 μl) כדי להעריך את המספר הכולל של התולעים בקעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה הצינור של התרבות חיידקי OP50 קפוא (1.6 פרוטוקול) ולהוסיף 3 מ&quot;ל של 50% OP50 בתרבות תולעת לכל 500,000 התולעים בקעו. לנער את הבקבוק על סל&quot;ד 100 ב 20 ° C. תולעים תתפתח הזחלים L4 וצעירים כ 51 שעות. OD600 של חיידקים יש על 2.200 בהתחלה. צג את כמות החיידקים על ידי ספיגת ולהוסיף עוד אם OD 600 יורד מתחת 0.900. </li></ol> 3. תולעת איסוף מחלק יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet סרולוגיות סטרילי להעביר כ 0.5 מ&quot;ל של התרבות תולעת מושעה עד צלחת NGM תקן אגר. הצג את התולעים עם stereomicroscope לוודא כי רוב L4 או זחלים צעירים. L4 הזחלים יהיה מקום ברור הגחון באמצע הגוף. לצעירים יהיה מעט גדול יותר לא יהיה מקום ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את תרבות תולעת לתוך צינורות 50 מ&quot;ל סטרילי והמקום צינורות במעמד מבחנה על benchtop. אפשר התולעים להסתפק בערך 10 דקות. הסר את supernatant על ידי שאיפה או pipetting. הערה: שלב זה יכול להיות חשוב להסיר ביצים שלא נתבקעה או תולעים שלא לפתח, כי הם יסתפקו איטי יותר L4 הזחלים ומבוגרים צעירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל התולעים לתוך צינור שטיפה 50 מ&quot;ל יחיד עם חיץ NGM עם מרק LB 1% (LB NGM +) 3-4 פעמים כדי להסיר את החיידקים. הערה: זה נעשה כמיטב ידי איסוף תולעים בבית RCF 500 למשך 30 שניות והחלפת supernatant עם NGM טרי + חיץ LB בצנטריפוגה מתנדנד, דלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, למלא את הצינור עם NGM + חיץ LB כדי מ&quot;ל 50 ויוצקים לתוך בקבוק תולעת אישית מחלק. הוספת בר קטן מערבבים ומערבבים כדי לשמור על התולעים על תנאי. ספירת המספר דואר של תולעים בשלוש 5 טיפות μl כפי שצוין לעיל. מדולל עם LB + NGM עד שאתה מקבל 12-15 תולעים לכל טיפת 5 μl (~ 2.5-3.0 תולעים / μl). הערה: מינימום של כ -20 מ&quot;ל (60,000 תולעים), יש צורך למלא את החלל המת של הבקבוק מחלק קלטת מנפק. כל צלחת 384 גם דורש כ -35,000 תולעים או 11.5 מ&quot;ל של תולעים תנאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת קלטת 10 מחלק μl ו לעקר ידי תחול עם אתנול 70%. שטפו את אתנול על ידי תחול עם מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הקצה של הקלטת מחלק לתוך הבקבוק כך שיהיה בדיוק מעל הבר ומערבבים מבלי לשבש את התנועה. ודא כי את התולעים נשארים תלויים ברחבי הבקבוק כולו. תוכנית מנפק לוותר במהירות נמוכה עם 2 טרום פולסים. הממשלה לרוץ לפחות 10 מ&quot;ל של תולעים תנאי. מלא צלחות הצורך במהירות כדי למנוע את התולעים להתיישב בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחות עם הקלטת לנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמי את הצלחות על פלטפורמה רועד באינקובטור בטמפרטורה המתאימה assay שלך. אל ערימת הצלחות. </li></ol> 4. Fluorescence ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך היעד קורא microplate כדי למדוד את עוצמת הקרינה של כל אחד גם עם הגל הפליטה עירור המתאים (מסננים assay שלנו: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יחס ה-GFP / RFP ו לנרמל עם הקריאה של בארות הביקורת (ללא הפעלת המתחם) כדי לקבוע את ההבדל פי המדויק של עוצמת הקרינה נגזר טיפולים בודדים. </li></ol> 5. נציג תוצאות: SKN-1 שלנו assay משתמש זן משולב chromosomally כתב כפול (VP596). כפי שמוצג באיור 1, מספר תולעים קשורה גם לנפח לוותר. כפי שמוצג איורים 2 א ו -2, GFP סך הקרינה לכל RFP גם הוא לשחזור מאוד מבאר לבאר פני צלחת 384 באר. כפי שניתן לראות בתרשים 2C, un-Induced Pgst-4: על פני 384 בארות RFP: GFP הקרינה קשורה באופן ליניארי על Pdop-3:. כאשר כפי שבאה לידי ביטוי ביחס של ה-GFP / RFP, הקרינה הופך לשחזור מאוד מבאר לבאר פני צלחת 384 באר (השוו מקדם השונות של איור 2D ל 2A) להדגים את היכולת של Pdop-3:: כתב RFP להפחית השתנות. כפי שמוצג באיור 3, הגיוס של קרוב ל GFP RFP עם SKN-1 הפעלת xenobiotic (38 מיקרומטר juglone) היא חזקה מאוד לשחזור פני צלחת 384 באר. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. מספר תולעים לעומת נפח לוותר. תולעים היו מדולל כדי 2/μl כ וויתר לתוך צלחת 24 באר ספירה ידנית עם stereomicroscope. N = 8 בארות לפי נפח. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. פלואורסצנטי סך של תולעים לוותר לתוך צלחת 384 היטב ניתנת לשחזור. תולעים היו מדולל ל μl 2.5/μl כ ו 30 היה לוותר גם לתוך כל צלחת של 384 באר. GFP (א) ו - RFP (ב) הקרינה של כל הבארות היה מקדם השונות מתחת ל -9%. (ג) ה-GFP הקרינה קשורה מאוד RFP פלואורסצנטי. (ד) חישוב יחס ה-GFP כדי RFP הפחית את מקדם השונות אל מתחת ל -6% (A, B, ו-D) קווי מוצק לציין את האמצעים קווים שבורים לציין שלוש סטיות תקן מעל או מתחת מתכוון. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="איור 3"/> . איור 3 הפעלה של Pgst-4:: ה-GFP היא איתנה ועקבית. כ -75 L4 תולעים היו לוותר על כל הבארות של צלחת 384 באר juglone 38 מיקרומטר נוספה בכל טור אחרים. GFP ו RFP הקרינה נמדדה לאחר 21 שעות של דגירה. יחס ממוצע הקרינה היחסית של כל בקרה (1.0) ו juglone בארות (8.9) מסומנים קווי מוצק. שלוש סטיות תקן מעל לשלוט אומר ומתחת מתכוון juglone מסומנים קווים שבורים.

<ol>
	<li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade.">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+versatile+platform+for+drug+discovery.">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).</li><li>Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD40+repeat+protein+WDR-23+functions+with+the+CUL4/DDB1+ubiquitin+ligase+to+regulate+nuclear+abundance+and+activity+of+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans.">The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).</li><li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide-responsive+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).</li><li>Tullet, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+inhibition+of+the+longevity-promoting+factor+SKN-1+by+insulin-like+signaling+in+C.+elegans.">Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans.</a> Cell. 132, 1025-1038 (2008).</li><li>Oliveira, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-adapted+stress+and+longevity+gene+regulation+by+Caenorhabditis+elegans+SKN-1/Nrf.">Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf.</a> Aging Cell. , (2009).</li><li>Park, S. -. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8, 258-269 (2009).</li><li>Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+chemoprevention+mechanisms+mediated+through+the+Keap1-Nrf2+pathway.">Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway.</a> Antioxid Redox Signal. , (2010).</li><li>Kwak, M. K., Kensler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+NRF2+signaling+for+cancer+chemoprevention.">Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).</li><li>Leiser, S. F., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+signaling,+a+mechanism+for+cellular+stress+resistance+in+long-lived+mice.">Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice.</a> Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).</li><li>Link, C. D., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li><li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity.">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li><li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide,+a+harmful+substance+in+food.">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li><li>Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+extrasynaptic+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).</li><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans, a Practical Guide. , (2005).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מציגים שיטה culturing מחלק מספר גדול של נמטודות מהונדס. הציוד המשמש תולעים culturing הוא סטנדרטי עבור מעבדות ביצוע שיבוט מולקולרי והטיפול נוזלי וציוד הקרינה הוא סטנדרטי עבור מעבדות לעיבוד כמויות גדולות של microplates. שיטות אחרות של מחלק מספר גדול של חיים ג elegans דורשים הח?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> LB מרק </td><td> מחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> מרק נהדר </td><td> מחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ Multi-HT מצב microplate Reader </td><td> BioTek </td><td></td><td> מסננים: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Dispenser בחר </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תולעת מחלק צפחת </td><td> דרום מדעי Inc, Micanopy, פלורידה </td><td></td><td> אישית התאספו (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplates </td><td> גריינר Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> איטום לנשימה קלטת </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> Acros </td><td> 121640010 </td><td> Juglone מומס DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans זן מהונדס </td><td> מחבר של המעבדה </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP ו Pdop-3: RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains

תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) היא גישה חזקה לזיהוי מאפננים כימיים של תהליכים ביולוגיים. עם זאת, תרכובות רבות שזוהו באמצעות מסכי התרבות מודלים התא נמצאים לעתים קרובות להיות רעילים או פעילים פרמקולוגית in vivo 1-2. הקרנת במודלים של בעלי חיים שלם יכול לעזור למנוע מהמלכודות הללו ולייעל את הדרך לפיתוח תרופות. סי אלגנס הוא אורגניזם מודל תאיים גם מתאים HTS. הוא קטן (&lt;1 מ&quot;מ) יכול להיות מתורבת כלכלית לוותר על נוזלים. ג elegans הוא גם אחד במודלים של בעלי חיים הכי ממושמע בניסוי המאפשר זיהוי מהיר ומפורט של התרופה למצב של פעולה 3. אנו מתארים פרוטוקול עבור culturing מחלק זנים הניאון של C. elegans להקרנה תפוקה גבוהה של ספריות כימי או זיהוי של מזהמים סביבתיים אשר משנים את הביטוי של גן מסוים. כמות גדולה של תולעים מסונכרן התפתחותית גדלים בתרבות נוזלי, שנקטפו, התרחצתי, תלוי בצפיפות מוגדר. תולעים מתווספים ואז שחור, השטוחה 384 גם באמצעות צלחות מנפק נוזל peristaltic. מולקולות קטנות מספריית כימיים או דגימות הבדיקה (למשל, מזון, מים או אדמה) ניתן להוסיף בארות עם תולעים. In vivo, בזמן אמת, עוצמת הקרינה נמדדת עם הקורא microplate פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל גן ועין מתנהלת ב C. elegans עבורו כתב מתאים זמין. הלחץ ועין מתנהלת הרבה מסלולים תעתיק התפתחותיים מוגדרים היטב ב C. elegans ו-GFP זנים מהונדס כתב כבר קיים עבור רבים מהם 4. בשילוב עם הכתבים מהונדס מתאים, השיטה שלנו יכולה לשמש מסך עבור מאפננים מסלול או לפתח מבחני biosensor חזקים מזהמים סביבתיים. אנו מדגימים C. שלנו elegans תרבות מחלק פרוטוקול עם assay HTS שפיתחנו כדי לפקח על C. &#39;n&#39; אלגנס כובע גורם שעתוק צווארון SKN-1. SKN-1 ו Nrf2 יונקים שלה homologue להפעיל גנים cytoprotective במהלך סטרס חמצוני xenobiotic 5-10. Nrf2 מגן יונקים מגיל בהפרעות הקשורות רבות כגון סרטן, ניוון מוחיים, דלקת כרונית הפכה ליעד מרכזי כימותרפיות 11-13. Assay שלנו מבוססת על עיתונאי ה-GFP מהונדס עבור SKN-1 היעד הגן GST -4 14, אשר מקודד גלוטתיון-s 6 transferase. הכתב GST -4 גם biosensor כימיקלים xenobiotic ו חמצוני כי להפעיל SKN-1 והוא יכול לשמש כדי לזהות רמות נמוכות של מזהמים כגון acrylamide ו-מתיל כספית 15-16.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains at JoVE.com

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק של<em&gt; ג elegans</em&gt; זני לבטא חלבונים כתב ניאון מתואר כי אינו דורש ציוד יקר מיון. גישה זו ניתן להחיל ועין מתנהלת רבים<em&gt; ג elegans</em&gt; גנים לגילוי סמים או biosensing של מזהמים.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

high-throughput-screening-biosensing-with-fluorescent-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

17.8K Views.  University of Florida. הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק של ג elegans זני לבטא חלבונים כתב ניאון מתואר כי אינו דורש ציוד יקר מיון. גישה זו ניתן להחיל ועין מתנהלת רבים ג elegans גנים לגילוי סמים או biosensing של מזהמים.

Video: High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...