אנו מודים ד Braendle, CL קורץ ופ Montañana-סאנצ&#39;יס על תרומתם. פרויקט זה נתמך על ידי תרומות של ANR ו האזורית Conseil PACA, ואת המימון המוסדי מ INSERM ואת CNRS.

<ol>
	<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li><li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li><li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting.">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li><li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes.">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li><li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+high-throughput+screens:+the+C+elegans+model.">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1551-8507 (2006).</li><li>Powell, J. R., Ausubel, F. M., Ewbank, J., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Caenorhabditis+elegans+Infection+by+Bacterial+and+Fungal+Pathogens.">Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens.</a> Methods Mol Biol. 415, 403-427 (2008).</li><li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNP-1/ATR-X+acts+with+RB,+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans.">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions.">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li><li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li><li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data.">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li><li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans.">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li><li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20&#47;GCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis.">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20&#47;GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li><li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome.">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+in+a+dish:+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis.">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li><li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay.">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li><li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2.">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

המעבדה משתפת פעולה עם האיחוד Ewbank Biometrica Modul ו-Bio.

<p class="jove_content"&gt; בפרוטוקול הנוכחי מאפשר בקנה מידה גדול ההקרנה RNAi ב<em&gt; ג elegans</em&gt; על התקשורת מוצקים, באמצעות רמת הביטוי של הגן כתב ניאון כמו לקריאה החוצה. זה כבר מותאם עם כלים אוטומטיים כדי להקל על מבחני תפוקה גבוהה, ומאפשר טיפול קל ומהיר של מספר גדול של דגימות, באופן יעיל, אמין לשחזור. שיטות אחרות תוארו שאינם מסתמכים במידה כה רבה על טיפול אוטומטי מדגם נוזלי<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; היבט אחד הארגוני המפתח בפרוטוקול היה פיתוח של שיטת החזקה של מעקב אחר מדגם של התאמת תוכנה מסחרית MBioLIMS להליך מסך RNAi בשיתוף עם ModulBio החברה. בכל שלב של ההליך, צלחות מזוהים כעת ע&quot;י ברקודים שנוצר בתוך LIMS. כמו LIMS גם מתעדת את זהותם של שיבוטים של כל אחד גם על כל צלחת, הולך מבאר לגן המשוערת היא פשוטה. ומעבר זה, את הקישורים LIMS ל WormBase באתר הקהילה, המאפשר גישה ישירה לנתונים מולקולרית ופונקציונלית על הגן נתון. LIMS גם מאפשר ניתוח להתנהל על הצלחת או אפילו ברמה כרומוזום ו-הגנום כולו. עבור ניתוחים אלה, הנתונים מאוחסנים באופן התואם לחלוטין את הכלים שתוארו קודם לכן, כגון COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; נקודה אחת ניסיוני קריטי השיטה היא התאמת כמות המזון ביחס למספר של תולעים. מבחני רבות, חיוני כי תולעים לא למות מרעב בסוף הניסוי, אך חשוב גם לא להיות יותר מדי אוכל בהתחלה. ראינו כי צפיפות גבוהה של מזון פוחתת הקרינה אינדוקציה בפרוטוקול באמצעות תולעים הנושאים עמ &#39;<em&gt; NLP-29</em&gt; :: כתב ה-GFP. זה עשוי לשקף את היעילות זיהום פחתה כאשר תולעים זה בתרבית חיידקים יותר מדי (BS, תוצאות שלא פורסמו). יחד עם זאת, התנאים והתרבות של חיידקים RNAi הוא גם חשוב, כי זה קובע אם dsRNA מופק ברמה אופטימלית. כמה פרוטוקולים בקנה מידה גדול RNAi דורשים תרבות של RNAi שיבוטים על צלחות אגר לפני זריעת תרבויות נוזלי<sup&gt; 8</sup&gt;. קיבלנו להשתקת גנים חזקים השמטת שלב זה. בחרנו לגידול העודף של כל תרבות על מנת להבטיח תוצאות הומוגניות. פרוטוקול תיאר למעשה מספק חומר מספיק כדי לנהל את 2 או 3 מסכים במקביל. למען השגת תוצאות חזקות ביותר, אנחנו בעד, לעומת זאת, מנהלת מסכי בשני עותקים באמצעות תרבויות עצמאיות של תולעים, חיידקים RNAi ו נבגי פטריות.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; שלב קריטי נוסף קשור באמצעות מדיום שאינו לח מדי ולא יבש מדי. אם הצלחות לא יבשים מספיק, חיידקים RNAi לא להתייבש כראוי תולעים ישחו במהלך assay. זה יכול לגרום לבעיות. לדוגמה, תולעים לא נגועים בצורה יעילה על ידי<em&gt; ד coniospora</em&gt; בנוזל (כ Couillault, תוצאות שלא פורסמו). מצד שני, צלחות יבשות, osmolarity של עליות בינוני תרבות. זה יש השפעות ישירות על הפיזיולוגיה תולעת<sup&gt; 17</sup&gt;, כולל אינדוקציה של כמה גנים פפטיד מיקרוביאלית, כגון<em&gt; NLP 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. נפח בשימוש לוותר תולעים נבגי הוא קריטי כדי לאפשר ייבוש יעיל ומהיר. אם יותר מ 10 μL של נוזל נוסף צלחות טריים, בארות את יכולה לקחת הרבה שעות לייבוש. זה יכול להיות שקשה להשתמש בשיטות רובוטיות כדי להוסיף תולעים ללוחות. לדוגמה, תולעת זו היא לוותר על Biosort ב μL סביב 1 של נוזל. בשלב זה אנו להפיץ את התולעים באופן ידני כמו גם מאפשר לנו להתגבר על הנטייה של תולעים פתרון משקעים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אנחנו קודם לכן דיווחו התאמת Biosort שאיפשר 96-1 גם הצלחת להיות מנותח ב -36 דקות<sup&gt; 19</sup&gt;. יצרנית UBI מכונת מציעה כעת שינוי של Biosort כדי להקטין עוד יותר את זמן הניתוח. עם &quot;FastReFlex&quot;, דגימות מנותבים ישירות דרך התא זרימה לניתוח, תוך עקיפת המסנן בועות המלכודת. התוצאה היא הפחתה משמעותית של זמן עבור רכישת נתונים, צלחת שלמה יכול להיות מנותח 22 דקות המאפשר כ -20 צלחות להיות מטופלים ליום. אם הצלחות לא הוקפאו, לעומת זאת, לא היה מרווח 8 שעות בין הראשונים והאחרונים. לאור משך הזמן הקצר יחסית של הניסוי, עם זיהום שנמשך רק 18 שעות, זה היה להציג את המשתנה מקובל על צלחות. לא רק צלחות הקפאת לפני ניתוח לפתור את הבעיה, אבל זה חיוני גם בהקשר של תפוקה גבוהה כמו ניתוחים, עם פרוטוקול הנוכחית סטנדרטיים נוזלי טיפול רובוטים, 2 אנשים יכולים בקלות לעבד עד 50 צלחות בשבוע. נכון לעכשיו, יש מסך שגרתי 30 צלחות בשבוע, מה שמאפשר המסך הגנום כולולהתנהל פעם אחת פחות מ 2 חודשים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אחת התכונות המעניינות של פרוטוקול זה היא העובדה כי היא משתמשת אגר מוצק, מה שמאפשר מבחני שלא ניתן לבצע התרבות נוזלי. כמו תולעת הפיזיולוגיה משתנה בהתאם לתנאים תרבות<sup&gt; 20,21</sup&gt;, להיות מסוגל לבצע מבחני על מצע מוצק יכול גם להשלים הרגילים נוזל מבוססי מסכי. עבור פנוטיפים מסוימים (תנועה למשל), הניתוח יכול להתבצע ישירות עם 96-גם מוצקים צלחות בינוניות. על המסך הנוכחי, עם זאת, כפי Biosort לא יכול לטעום מהצלחות בינוניים מוצקים, תולעים מועברים 1 לנוזל לפני ההקפאה. מצד שני, Biosort COPAS מאפשר ניתוח כמותי multiparametric תואמת המדידה של פנוטיפים שונים. סביר להניח כי עבור מסך נתון לא כל הפרמטרים הנמדדים יהיה העיקרית לקריאה החוצה. עם זאת, מדידות אלה יכול להיות שימושי עבור כמה סיבות. הם מאפשרים 1 כדי לקבוע אם assay רץ כראוי. לדוגמה, אפשר לבדוק את המספר ואת הגודל של התולעים היטב כל אחד מהם. רק כאשר שיבוט RNAi צריך לחסום את הצמיחה או רבייה צריך להיות סטייה מהערכים הצפויים. וולס עם פחות מ -20 תולעים ו / או בעלי חיים קטנים יותר (30% TOF) לעומת סטןגודארד שליטה ללא השפעה על הצמיחה (<em&gt; למשל GFP (RNAi</em&gt;)) ניתן לשלול מן הניתוחים הבאים. פונקציה של שיבוטים אלו ניתן לטפל באמצעות פרוטוקול חלופי שבו תולעים נחשפים לחיידקים RNAi אחרי ההתפתחות שלהם היא מתקדמת היטב<sup&gt; 15</sup&gt;. הפרמטרים השונים יכול לשמש גם כדי לחדד את הגן המועמד (HIT) הבחירה, למשל, הגבלת להיטים רק לאלה המשפיעים פלואורסצנטי ירוק, אבל לא אדום. השיטה המדויקת נבחר לבחירת להיטים יהיה תלוי בסוג המסך המדויק לקריאה החוצה. נוכח המורכבות של הנתונים המופקים מן המסך הגנום כולו כמותית, בשיתוף עם סטטיסטיקאי ייתכן שיהיה צורך.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; פרוטוקול אנו מתארים ניתן להתאים בקלות סוגים אחרים של מבחני. לדוגמה, בשלב הזיהום<em&gt; ד coniospora</em&gt; יכול להיות מוחלף על ידי פתוגן אחר מסוגל להדביק על התקשורת מוצקים. זה שימושי באופן פוטנציאלי שכן מצאנו כי רבים מהגורמים החשובים ארסיות על זיהום marcescens Serratia בתרבות נוזל לא משחק תפקיד במהלך ההדבקה על מצע מוצק (א &#39;Pradel, תקשורת אישית). הפרוטוקול הוא גם תואם באופן מלא עם בדיקות של תרכובות כימיקלים<sup&gt; 22-24</sup&gt;, או לזהות תרכובות עם bioactivity שימוש בספריות שונות של חיידקים<sup&gt; 25</sup&gt;, אז צריך למצוא את השירות כללי<em&gt; ג elegans</em&gt; קהילת המחקר.</p

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD ניתוח מערכות </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD ניתוח מערכות </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> דבק AeraSeal הסרט </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> איזופרופיל β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 צלחת באר עמוקה </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 גם צלחת שטוחה </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 צלחת עגולה גם </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נץקאן רובוט </td><td> נץקאן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> האיחוד Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

התערבות RNA היא שיטה רבת עוצמה כדי להבין תפקוד הגן, במיוחד כאשר נערך בקנה מידה כל הגנום, ובהקשר כמותית. ב C. elegans, תפקוד הגן ניתן הפילו בפשטות וביעילות על ידי האכלה עם תולעים חיידקים המבטאים dsRNA המתאים גן ספציפי 1. תוך יצירת ספריות של שיבוטים RNAi מכסה את רוב ג elegans הגנום 2,3 פתחה את הדרך האמיתיים מחקרים גנומית פונקציונלית (ראה למשל 4-7), רוב השיטות מבוססות הן מייגע. מוי ועמיתיו פיתחו חצי אוטומטיות פרוטוקולים המאפשרים הגנום כולו מסכים 8. הגישה מתבססת על הדמיה מיקרוסקופית וניתוח התמונה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול חלופי המסך הגנום כולו תפוקה גבוהה, המבוססת על טיפול הרובוטית של חיידקי RNAi שיבוטים, ניתוח כמותי באמצעות Biosort COPAS (האיחוד Biometrica (UBI)), ותוכנה משולבת: MBioLIMS (ניהול מעבדה מערכת מידע מ Modul-Bio) טכנולוגיה המספקת תפוקה מוגברת על ניהול נתונים ומעקב אחר המדגם. השיטה מאפשרת מסכי להתנהל על צלחות בינוניים מוצקים. הדבר חשוב במיוחד עבור כמה מחקרים, כגון אלו בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות פונה ב C. elegans, מאז חיידקים מסוימים לא יעיל להדביק תולעים בתרבות נוזל. אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה כדי לכמת את החשיבות של גנים חסינות אנטי פטרייתי מולד ב C. elegans. במקרה זה, הגישה מתבססת על שימוש זן מהונדס נושאת גן אפידרמיס זיהום מושרה כתב ניאון, עם GFP בשליטת היזם של מיקרוביאלית פפטיד גן NLP 29 ו לכתב ניאון אדום בא לידי ביטוי ב constitutively האפידרמיס. זה האחרון מספק בקרה פנימית על שלמות תפקודית של האפידרמיסו transgene ספציפי להשתיק 9. כאשר התולעים בקרה נגועים על ידי הפטרייה הם לזרוח בירוק. דריסה על ידי RNAi גן נדרש-NLP 29 תוצאות הביטוי של הקרינה פחתה לאחר ההדבקה. נכון לעכשיו, פרוטוקול זה מאפשר יותר מ -3,000 שיבוטים RNAi להיבדק וניתח בשבוע, לפתוח את האפשרות של הקרנת הגנום כולו בתוך פחות מ 2 חודשים.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול<em&gt; ג elegans</em&gt; וספריות RNAi האכלה המאפשר מדידה אוטומטית של מספר פרמטרים כגון גודל, הקרינה ואת האטימות של תולעים בודדים באוכלוסייה. אנחנו נותנים דוגמה אחת של המסך כדי לזהות גנים המעורבים חסינות אנטי פטרייתי מולדת ב<em&gt; ג elegans</em&gt;.

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

quantitative-automated-high-throughput-genome-wide-rnai-screens-c

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

17.6K Views.  Université de la Méditerranée. אנו מתארים באמצעות פרוטוקול ג elegans וספריות RNAi האכלה המאפשר מדידה אוטומטית של מספר פרמטרים כגון גודל, הקרינה ואת האטימות של תולעים בודדים באוכלוסייה. אנחנו נותנים דוגמה אחת של המסך כדי לזהות גנים המעורבים חסינות אנטי פטרייתי מולדת ב ג elegans.

Video: Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות סי.

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Genetics

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Immunology and Infection

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

RNAi in C. elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target gene. In the nematode, C. elegans, RNAi is particularly easy and effective because it can be delivered simply by feeding the worms bacteria that express double stranded RNA (dsRNA) that is complementary to a gene of interest. First, this video will introduce the concept of RNA interference and explain how it causes targeted gene knockdown. Then, we will demonstrate a protocol for using RNAi in C. elegans, which includes preparation of the bacteria and RNAi worm plates, culturing of the worms, and how to assess the effects of RNAi on the worms. RNAi is frequently used to perform reverse genetic screens in order to reveal which genes are important to carry out specific biological processes. Furthermore, automated reverse genetic screens allow for the efficient knockdown and analysis of a large collection of genes. Lastly, RNAi is often used to study the development of C. elegans. Since its discovery, scientists have used RNAi to make tremendous progress on the understanding of many biological phenomena.

RNA Interference RNAi in Caenorhabditis elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target ...

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video