אנו מודים ד Braendle, CL קורץ ופ Montañana-סאנצ&#39;יס על תרומתם. פרויקט זה נתמך על ידי תרומות של ANR ו האזורית Conseil PACA, ואת המימון המוסדי מ INSERM ואת CNRS.

<ol>
	<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li><li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li><li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting.">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li><li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes.">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li><li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+high-throughput+screens:+the+C+elegans+model.">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1551-8507 (2006).</li><li>Powell, J. R., Ausubel, F. M., Ewbank, J., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Caenorhabditis+elegans+Infection+by+Bacterial+and+Fungal+Pathogens.">Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens.</a> Methods Mol Biol. 415, 403-427 (2008).</li><li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNP-1/ATR-X+acts+with+RB,+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans.">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions.">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li><li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li><li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data.">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li><li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans.">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li><li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20&#47;GCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis.">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20&#47;GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li><li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome.">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+in+a+dish:+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis.">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li><li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay.">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li><li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2.">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

המעבדה משתפת פעולה עם האיחוד Ewbank Biometrica Modul ו-Bio.

<p class="jove_content"&gt; בפרוטוקול הנוכחי מאפשר בקנה מידה גדול ההקרנה RNAi ב<em&gt; ג elegans</em&gt; על התקשורת מוצקים, באמצעות רמת הביטוי של הגן כתב ניאון כמו לקריאה החוצה. זה כבר מותאם עם כלים אוטומטיים כדי להקל על מבחני תפוקה גבוהה, ומאפשר טיפול קל ומהיר של מספר גדול של דגימות, באופן יעיל, אמין לשחזור. שיטות אחרות תוארו שאינם מסתמכים במידה כה רבה על טיפול אוטומטי מדגם נוזלי<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; היבט אחד הארגוני המפתח בפרוטוקול היה פיתוח של שיטת החזקה של מעקב אחר מדגם של התאמת תוכנה מסחרית MBioLIMS להליך מסך RNAi בשיתוף עם ModulBio החברה. בכל שלב של ההליך, צלחות מזוהים כעת ע&quot;י ברקודים שנוצר בתוך LIMS. כמו LIMS גם מתעדת את זהותם של שיבוטים של כל אחד גם על כל צלחת, הולך מבאר לגן המשוערת היא פשוטה. ומעבר זה, את הקישורים LIMS ל WormBase באתר הקהילה, המאפשר גישה ישירה לנתונים מולקולרית ופונקציונלית על הגן נתון. LIMS גם מאפשר ניתוח להתנהל על הצלחת או אפילו ברמה כרומוזום ו-הגנום כולו. עבור ניתוחים אלה, הנתונים מאוחסנים באופן התואם לחלוטין את הכלים שתוארו קודם לכן, כגון COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; נקודה אחת ניסיוני קריטי השיטה היא התאמת כמות המזון ביחס למספר של תולעים. מבחני רבות, חיוני כי תולעים לא למות מרעב בסוף הניסוי, אך חשוב גם לא להיות יותר מדי אוכל בהתחלה. ראינו כי צפיפות גבוהה של מזון פוחתת הקרינה אינדוקציה בפרוטוקול באמצעות תולעים הנושאים עמ &#39;<em&gt; NLP-29</em&gt; :: כתב ה-GFP. זה עשוי לשקף את היעילות זיהום פחתה כאשר תולעים זה בתרבית חיידקים יותר מדי (BS, תוצאות שלא פורסמו). יחד עם זאת, התנאים והתרבות של חיידקים RNAi הוא גם חשוב, כי זה קובע אם dsRNA מופק ברמה אופטימלית. כמה פרוטוקולים בקנה מידה גדול RNAi דורשים תרבות של RNAi שיבוטים על צלחות אגר לפני זריעת תרבויות נוזלי<sup&gt; 8</sup&gt;. קיבלנו להשתקת גנים חזקים השמטת שלב זה. בחרנו לגידול העודף של כל תרבות על מנת להבטיח תוצאות הומוגניות. פרוטוקול תיאר למעשה מספק חומר מספיק כדי לנהל את 2 או 3 מסכים במקביל. למען השגת תוצאות חזקות ביותר, אנחנו בעד, לעומת זאת, מנהלת מסכי בשני עותקים באמצעות תרבויות עצמאיות של תולעים, חיידקים RNAi ו נבגי פטריות.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; שלב קריטי נוסף קשור באמצעות מדיום שאינו לח מדי ולא יבש מדי. אם הצלחות לא יבשים מספיק, חיידקים RNAi לא להתייבש כראוי תולעים ישחו במהלך assay. זה יכול לגרום לבעיות. לדוגמה, תולעים לא נגועים בצורה יעילה על ידי<em&gt; ד coniospora</em&gt; בנוזל (כ Couillault, תוצאות שלא פורסמו). מצד שני, צלחות יבשות, osmolarity של עליות בינוני תרבות. זה יש השפעות ישירות על הפיזיולוגיה תולעת<sup&gt; 17</sup&gt;, כולל אינדוקציה של כמה גנים פפטיד מיקרוביאלית, כגון<em&gt; NLP 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. נפח בשימוש לוותר תולעים נבגי הוא קריטי כדי לאפשר ייבוש יעיל ומהיר. אם יותר מ 10 μL של נוזל נוסף צלחות טריים, בארות את יכולה לקחת הרבה שעות לייבוש. זה יכול להיות שקשה להשתמש בשיטות רובוטיות כדי להוסיף תולעים ללוחות. לדוגמה, תולעת זו היא לוותר על Biosort ב μL סביב 1 של נוזל. בשלב זה אנו להפיץ את התולעים באופן ידני כמו גם מאפשר לנו להתגבר על הנטייה של תולעים פתרון משקעים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אנחנו קודם לכן דיווחו התאמת Biosort שאיפשר 96-1 גם הצלחת להיות מנותח ב -36 דקות<sup&gt; 19</sup&gt;. יצרנית UBI מכונת מציעה כעת שינוי של Biosort כדי להקטין עוד יותר את זמן הניתוח. עם &quot;FastReFlex&quot;, דגימות מנותבים ישירות דרך התא זרימה לניתוח, תוך עקיפת המסנן בועות המלכודת. התוצאה היא הפחתה משמעותית של זמן עבור רכישת נתונים, צלחת שלמה יכול להיות מנותח 22 דקות המאפשר כ -20 צלחות להיות מטופלים ליום. אם הצלחות לא הוקפאו, לעומת זאת, לא היה מרווח 8 שעות בין הראשונים והאחרונים. לאור משך הזמן הקצר יחסית של הניסוי, עם זיהום שנמשך רק 18 שעות, זה היה להציג את המשתנה מקובל על צלחות. לא רק צלחות הקפאת לפני ניתוח לפתור את הבעיה, אבל זה חיוני גם בהקשר של תפוקה גבוהה כמו ניתוחים, עם פרוטוקול הנוכחית סטנדרטיים נוזלי טיפול רובוטים, 2 אנשים יכולים בקלות לעבד עד 50 צלחות בשבוע. נכון לעכשיו, יש מסך שגרתי 30 צלחות בשבוע, מה שמאפשר המסך הגנום כולולהתנהל פעם אחת פחות מ 2 חודשים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אחת התכונות המעניינות של פרוטוקול זה היא העובדה כי היא משתמשת אגר מוצק, מה שמאפשר מבחני שלא ניתן לבצע התרבות נוזלי. כמו תולעת הפיזיולוגיה משתנה בהתאם לתנאים תרבות<sup&gt; 20,21</sup&gt;, להיות מסוגל לבצע מבחני על מצע מוצק יכול גם להשלים הרגילים נוזל מבוססי מסכי. עבור פנוטיפים מסוימים (תנועה למשל), הניתוח יכול להתבצע ישירות עם 96-גם מוצקים צלחות בינוניות. על המסך הנוכחי, עם זאת, כפי Biosort לא יכול לטעום מהצלחות בינוניים מוצקים, תולעים מועברים 1 לנוזל לפני ההקפאה. מצד שני, Biosort COPAS מאפשר ניתוח כמותי multiparametric תואמת המדידה של פנוטיפים שונים. סביר להניח כי עבור מסך נתון לא כל הפרמטרים הנמדדים יהיה העיקרית לקריאה החוצה. עם זאת, מדידות אלה יכול להיות שימושי עבור כמה סיבות. הם מאפשרים 1 כדי לקבוע אם assay רץ כראוי. לדוגמה, אפשר לבדוק את המספר ואת הגודל של התולעים היטב כל אחד מהם. רק כאשר שיבוט RNAi צריך לחסום את הצמיחה או רבייה צריך להיות סטייה מהערכים הצפויים. וולס עם פחות מ -20 תולעים ו / או בעלי חיים קטנים יותר (30% TOF) לעומת סטןגודארד שליטה ללא השפעה על הצמיחה (<em&gt; למשל GFP (RNAi</em&gt;)) ניתן לשלול מן הניתוחים הבאים. פונקציה של שיבוטים אלו ניתן לטפל באמצעות פרוטוקול חלופי שבו תולעים נחשפים לחיידקים RNAi אחרי ההתפתחות שלהם היא מתקדמת היטב<sup&gt; 15</sup&gt;. הפרמטרים השונים יכול לשמש גם כדי לחדד את הגן המועמד (HIT) הבחירה, למשל, הגבלת להיטים רק לאלה המשפיעים פלואורסצנטי ירוק, אבל לא אדום. השיטה המדויקת נבחר לבחירת להיטים יהיה תלוי בסוג המסך המדויק לקריאה החוצה. נוכח המורכבות של הנתונים המופקים מן המסך הגנום כולו כמותית, בשיתוף עם סטטיסטיקאי ייתכן שיהיה צורך.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; פרוטוקול אנו מתארים ניתן להתאים בקלות סוגים אחרים של מבחני. לדוגמה, בשלב הזיהום<em&gt; ד coniospora</em&gt; יכול להיות מוחלף על ידי פתוגן אחר מסוגל להדביק על התקשורת מוצקים. זה שימושי באופן פוטנציאלי שכן מצאנו כי רבים מהגורמים החשובים ארסיות על זיהום marcescens Serratia בתרבות נוזל לא משחק תפקיד במהלך ההדבקה על מצע מוצק (א &#39;Pradel, תקשורת אישית). הפרוטוקול הוא גם תואם באופן מלא עם בדיקות של תרכובות כימיקלים<sup&gt; 22-24</sup&gt;, או לזהות תרכובות עם bioactivity שימוש בספריות שונות של חיידקים<sup&gt; 25</sup&gt;, אז צריך למצוא את השירות כללי<em&gt; ג elegans</em&gt; קהילת המחקר.</p

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD ניתוח מערכות </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD ניתוח מערכות </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> דבק AeraSeal הסרט </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> איזופרופיל β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 צלחת באר עמוקה </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 גם צלחת שטוחה </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 צלחת עגולה גם </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נץקאן רובוט </td><td> נץקאן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> האיחוד Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

התערבות RNA היא שיטה רבת עוצמה כדי להבין תפקוד הגן, במיוחד כאשר נערך בקנה מידה כל הגנום, ובהקשר כמותית. ב C. elegans, תפקוד הגן ניתן הפילו בפשטות וביעילות על ידי האכלה עם תולעים חיידקים המבטאים dsRNA המתאים גן ספציפי 1. תוך יצירת ספריות של שיבוטים RNAi מכסה את רוב ג elegans הגנום 2,3 פתחה את הדרך האמיתיים מחקרים גנומית פונקציונלית (ראה למשל 4-7), רוב השיטות מבוססות הן מייגע. מוי ועמיתיו פיתחו חצי אוטומטיות פרוטוקולים המאפשרים הגנום כולו מסכים 8. הגישה מתבססת על הדמיה מיקרוסקופית וניתוח התמונה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול חלופי המסך הגנום כולו תפוקה גבוהה, המבוססת על טיפול הרובוטית של חיידקי RNAi שיבוטים, ניתוח כמותי באמצעות Biosort COPAS (האיחוד Biometrica (UBI)), ותוכנה משולבת: MBioLIMS (ניהול מעבדה מערכת מידע מ Modul-Bio) טכנולוגיה המספקת תפוקה מוגברת על ניהול נתונים ומעקב אחר המדגם. השיטה מאפשרת מסכי להתנהל על צלחות בינוניים מוצקים. הדבר חשוב במיוחד עבור כמה מחקרים, כגון אלו בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות פונה ב C. elegans, מאז חיידקים מסוימים לא יעיל להדביק תולעים בתרבות נוזל. אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה כדי לכמת את החשיבות של גנים חסינות אנטי פטרייתי מולד ב C. elegans. במקרה זה, הגישה מתבססת על שימוש זן מהונדס נושאת גן אפידרמיס זיהום מושרה כתב ניאון, עם GFP בשליטת היזם של מיקרוביאלית פפטיד גן NLP 29 ו לכתב ניאון אדום בא לידי ביטוי ב constitutively האפידרמיס. זה האחרון מספק בקרה פנימית על שלמות תפקודית של האפידרמיסו transgene ספציפי להשתיק 9. כאשר התולעים בקרה נגועים על ידי הפטרייה הם לזרוח בירוק. דריסה על ידי RNAi גן נדרש-NLP 29 תוצאות הביטוי של הקרינה פחתה לאחר ההדבקה. נכון לעכשיו, פרוטוקול זה מאפשר יותר מ -3,000 שיבוטים RNAi להיבדק וניתח בשבוע, לפתוח את האפשרות של הקרנת הגנום כולו בתוך פחות מ 2 חודשים.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול<em&gt; ג elegans</em&gt; וספריות RNAi האכלה המאפשר מדידה אוטומטית של מספר פרמטרים כגון גודל, הקרינה ואת האטימות של תולעים בודדים באוכלוסייה. אנחנו נותנים דוגמה אחת של המסך כדי לזהות גנים המעורבים חסינות אנטי פטרייתי מולדת ב<em&gt; ג elegans</em&gt;.

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

quantitative-automated-high-throughput-genome-wide-rnai-screens-c

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

17.6K Views.  Université de la Méditerranée. אנו מתארים באמצעות פרוטוקול ג elegans וספריות RNAi האכלה המאפשר מדידה אוטומטית של מספר פרמטרים כגון גודל, הקרינה ואת האטימות של תולעים בודדים באוכלוסייה. אנחנו נותנים דוגמה אחת של המסך כדי לזהות גנים המעורבים חסינות אנטי פטרייתי מולדת ב ג elegans.

Video: Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).