The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

<ol>
	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף

אורגניזם המודל C. elegans מספק מערכת ניסיונית חזקה. זה קל לתרבות ומייצר צאצאים זהים גנטי בשפע עם מחזור חיים 3.5 יום מביצה ללהתרבות מבוגר (דרך שלבי זחל לנוער L1 עד L4). בשל גודלו הקטן, זה יכול להיות מבוגר בנוחות ב96-גם צלחות, להקל הקרנת מתחם. אנו מציגים פרוטוקול הקרנה פנוטיפי המבוסס על זנים של ג elegans הפועלים כin vivo חיישנים של רמות אנרגיה. 14 הפרוטוקול ישים לכל מעבדה, אם כי נדרש luminometer צלחת 96-היטב וקבינט סטרילי. זה חשוב כדי למנוע זיהום במבחנים על ידי שימוש בטכניקת מעבדה טובה. אם עובד באופן ידני, את המספר המרבי של צלחות נמטודות השגה הוא 13 לכל ניסוי המאפשר בדיקה של 2x צלחות תרופת 96-היטב וכולל שתי צלחות רכב. נציגי תוצאות מוצגות למורכבת המיטוכונדריה אני מעכב rotenonדואר, גנרטור paraquat סופראוקסיד, oxaloacetate ביניים מחזור חומצת לימון וארבע תרכובות עם פעילות מעכבת גחלילית בלוציפראז ידועה. שתי התרכובות הראשונות הובילו לירידה בפליטת אור כפי שחזו ואילו oxaloacetate הוביל לשיפור, עשוי לנבוע מדור גדול יותר של ה- ATP. ערכות נתונים oxaloacetate גם להדגים את השונות המהותיות בניסויים מבוססים על לוציפראז גחלילית ככתב. מינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים הם מומלץ לוודא חוסן של תגובות לתרכובות בלתי ידועות. העיכוב של פעילות לוציפראז גחלילית היה מזוהה עם assay במבחנה באמצעות ערכה מסחרית. 3 אחד המתחמים הביאו לעלייה משמעותית בקרינת GFP בקנה אחד עם מעכב הגדלת הרמות של גחלילית בלוציפראז באמצעות קשירת האנזים של לוציפראז פעיל מתויג GFP אתר, והופך אותו ליותר יציב. 15 במקרים מסוימים(לא במקרה הספציפי הזה) זה יכול להוביל לרמות גבוהות של פליטת אור כאשר המעכב שנעקר על ידי מצע עודף. 15 הוא, לכן, חשוב שלא לפרש את התוצאות בטעות מתרכובות שאינטראקציה עם אנזים הגחלילית כירידה או עליית רמות ה- ATP / פונקציה של המיטוכונדריה. שינויים באות הארה לעתים קרובות למדי לתאם עם מדידות נוספות של בריאות כגון תנועה, התפתחות וצמיחה. כדוגמא, מתחם הוא מעכב לוציפראז חשוד אם ירידה דרמטית באות פליטת אור מזוהה אך תולעים הם נבדלים מבקרות על ידי תצפית מיקרוסקופית. עלייה בקרינת GFP, לא מוסברת על ידי גידול או autofluorescence מתחם, יכולה גם להצביע על מעכב. מספר מעכבי לוציפראז 15 ידוע וכבר נכנס לPubChem. לכן במקרה הראשון, זה תרגול טוב להתייעץ מידע על מעכבי לוציפראז מוחזקים על ידי PubChem; אחרי testing של השפעות המתחם במבחני חוץ גופייה עם האנזים המטוהר 3 ו / או אישור של השפעות על תפקוד המיטוכונדריה ידי אמצעים נוספים. 16,17 מדידות הקרינה GFP מאפשרות זיהוי של רמות לוציפראז גחלילית (וזיהוי הפוטנציאל של כמה מעכבי אנזים בלוציפראז כפי שפורט לעיל) מה שהופך את מקרה חזק למדידת נקודת קצה זו לצד פליטת אור במידת האפשר. נורמליזציה של קריאות פליטת אור לGFP היא גם אמצעי לטיפול חשבונאי בשינויים במספרי תולעת בין בארות (אם כי זה יכול גם להיות מושגת על ידי הכללה של משכפל טכני מרובה). לרגישות רבה יותר, חשוב להפחית הקרינה רקע מקריאות. הפרוטוקול מעריך את התרומה של ההשעיה החיידקים לקרינת הרקע, לעומת זאת autofluorescence נמטודות לא היווה (הגבלה של assay הנוכחי, קריטית במיוחד לכל סטו הזדקנותבהתחשב בכך שמת עליות autofluorescence נמטודות עם גיל). גם autofluorescence של תרכובות מבחן צריך להיות מוערך במקביל. הנורמליזציה GFP הייתה נראית הכרחית שבו חוקרים מבקשים להתאים את הפרוטוקול כדי להשוות בריכות ATP סלולריות במוטציות גנטיות שונות או אחרי ההשתקה של גנים שונים, במטרה לשלוט על כל הבדלי מתח ברמת הביטוי של transgene פליטת אור. פרמטרים קריטיים בפרוטוקול כוללים את השלב ההתפתחותי שבו חשיפה היא יזם, אורך החשיפה, וקבלת מספרים דומים של נמטודות בבארות שונות. חשיפה יכולה להתחיל בכל שלב של התפתחות של נמטודות, אולם שלב L3 ומעלה עדיפה. משלב זה והלאה, נמטודות תלויה בזרחון חמצוני לפיתוח לבגרות, כפי שמעיד גידול מאוד משמעותי בתוכן mtDNA, צריכת חמצן ורמות ה- ATP. 18,19,20 הפרוטוקול הנוכחי יוזם ירידייור בשלב L4. הסיבה לaliquoting נמטודות ל96-גם צלחות רק בשלב זה (ולא כאשר הם סיפקו ראשון עם מזון בשלב L1), היא שלמרות צלחות מונחות בתאים לחים כדי למזער אידוי, מידת האידוי עדיין מתרחשת ב החממה שלנו רועד, נראית כטיפין קטנות מאוד להרכיב על העפעפיים (זה לא יכול להיות בעיה עם חממות רועדות אחרות). על ידי aliquoting נמטודות לצלחות ממש לפני התוספת של תקני סמים, ריכוז התרופה בפועל אינו מושפע מכל וריאציה קטנה בנפח בשל התאדות. טעינת צלחת נמטודות עם רכב היחיד היא שימושית כדי לבדוק שנמטודות חולקו באופן שווה בין בארות. כל הבדלים מובהקים לרכב רק צלחת יהיו מעידים על טכניקה לקויה מחלק נמטודות לבארות. אורך החשיפה הוא גורם חשוב לשקול. אם השפעות על מצב אנרגיה באופן עצמאי של צמיחה של עניין, פרוtocol יכול להיות שונה כדי להתאים חשיפות קצרות יותר (מתגובות כמעט מיידיות ל, למשל, 2 שעות). מצד השני, כניסה של תרכובות לג רקמות elegans עשויות לקחת קצת זמן. לדוגמא נדרשות 12-24 שעות כדי להשיג ריכוזים פנימיים מרביים של רזברטרול ו5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUDR). 21 לכן, חשיפה ארוכה יותר (18 עד 24 שעות) עשויות להיות מוצדקות על מנת למקסם את רמות חשיפה. זמן החשיפה צריך להיות מוגבל לפעמים שאינם מאפשרים רמות משמעותיות של רבייה להתקיים בבאר. אנו ממליצים שהזמן התפתחותי הכולל של נמטודות נשמר תחת 66-67 שעות. למרות נוח, נמטודות הם מעוברת עד אז ויזמה egglaying. עם זאת מצאנו קריאות פליטת אור מהכנות ביצה להיות זניח (לא מוצג). ביטוי transgene מונע sur-5 האמרגן מזוהה ראשון רק 01:58 שעות וחצי לאחר הפריה בשלב 100 התא 22 וגקליפת הביצה hitinous עשויה להגביל כניסה של luciferin. אחרים מצאו כי ביצי embryonated לא תרמו באופן משמעותי לחילוף החומרים של מבוגרים הרה להולדת. 23 עם זאת, תנאים המאפשרים ייצור צאצאים משמעותי יש להימנע. אם העדיף, לוח הזמנים הניסיוניים יכול להיות מוזזים לאחור: יש לנו יזמנו בעבר חשיפה לרעלן סביבתי בשלב (36 שעות) הזחל מאוחר L3 וביצעו מדידות פליטת אור וGFP ב 55 שעות 2 רקעים לחלופין, גנטיים שתנאים סטריליים. יכול לשמש כדי למנוע ייצור צאצאים, כמו למשל FER-15 (B16) השני; FEM-1 מוטציה כפולה IV (hc17) אשר יכול להישמר על 15 מעלות צלזיוס, אך הוא סטרילי בC ° 25. 24 השימוש בFUDR לגרום לעקרות אינו מומלץ כמו זה יכול בעצמו משפיע על חילוף חומרים נמטודות. 25 assay יכול גם להתבצע בזנים עם העור הקרני חדיר יותר כגון פסד של funct החלקייון אוטובוס-8 מוטציות שהם multidrug רגיש בשל להגדיל חדירות של תרופות. 26 זה יקלו חשיפות וריכוזים נמוכים מתחם קצרים יותר. התנאים להוספת luciferin לנמטודות אלה עשויים גם צריכים התאמה כלומר, 1% DMSO ו0.05% Triton-X100 במאגר הארה לא ייתכן שיידרשו כדי לשפר את זמינות luciferin. הפרוטוקול משתמש 1% DMSO כרכב למסירת מתחם. למרות שאינו קטלני, ריכוז זה של DMSO יש כמה תופעות ביולוגיות כפי שכבר דנו בפרסום קודם. 3 רבים של ספריות תרופה הזמינות ערוכים 100% DMSO, בריכוזים שיהיו מתאימים למבחנים מבוססי תאים לאחר הדילול של רכב 0.1%. ריכוזים גבוהים יותר מתחם נדרשים לעורר תגובות בג elegans בהשוואה לתאים אנושיים, כך שלעתים קרובות לא ניתן לערוך מבחני בנמוכים מ 1% DMSO. שוב, השימוש בזנים עםיותר העור הקרני חדיר עלול להוביל לבדיקה עם ריכוזים נמוכים של רכב. ריכוזים של% גבוהים יותר מאשר 1 DMSO אינם מומלצים. זמן דגירה סט עם luciferin לקראת קריאה צריך להיות דבק. כפי שניתן לראות בעבר, הארה מגיעה לרמות המרביות שלה בתוך דקות השניה לאחר הוספת luciferin, שנותר יציב יחסית ל5 דקות הראשונות, ואחריו ירידה הדרגתית איטית בהארה על 30 דקות הבאות 1. יכולים להתבצע תגובות הקינטית לכימי מסוים בשלב ראשוני זה של 30 דקות אחרי מחלק ראשוני של luciferin. הפרוטוקול כרוך צעד רעב הבא אוסף של ביצים כדי להשיג סנכרון של אוכלוסיית נמטודות. אנו ממליצים סנכרון של אוכלוסיות מבחן נמטודות מאז שלבי התפתחות שונים נבדלים ברמות ה- ATP סלולריות ועשויים להגיב באופן שונה לתרכובות הבדיקה. על ידי ביצוע הרעב במלא Sבינוני בניגוד לM9, נמטודות הבקיעה מסופקות עם מקור פחמן (אתנול), כך זחלים שלא לפתח אך לא מורעבות לחלוטין. 27,28 זה גם הוכח שנעצר L1 של דרוכים לתגובה מהירה למזון ו שיעור L1 נורמלי צמיחה מושגת בתוך 3 שעות לאחר אוכל הופך להיות זמין. 29 עם זאת, האפשרות שצעד הרעב עשוי לשנות את חילוף החומרים של ג לא ניתן לשלול elegans. 30 מסיבה זו באורך של רעב לא יעלה על 24 שעות (18 שעות מספיקות לסנכרון). ייתכן שיש לי מעבדות מסוימות את האפשרות של שימוש Biosorter קופאס לסנכרון גיל עוקף את צעד הרעב לגמרי. ייתכן שיש לי מעבדות אחרות העדפה להרחבת אוכלוסיית נמטודות על תקשורת מוצקה (צלחות NGM עם OP50) לפני ההלבנה (שלב 3.1) וזה יעבוד היטב גם. אנו משתמשים במדיום S במהלך חשיפת מתחם כמדיום סטנדרטי עבור culturing נמטודות, however תקשורת אחרת ניתן לבחור, למשל בינוני K או די מים קשים EPA משמש לעתים קרובות ללימודי ecotoxicological. 31,32 הפרוטוקול מספק אמצעי לסינון ולזהות מועמדים לבדיקות נוספות במונחים של ההשפעות על תפקוד המיטוכונדריה. בשלב הסינון ראשוני סביר להניח כי כמה תרכובות יהיו כבר החמיצו בשל נבדק רק אחד ריכוז, לכן מסכי תרופה לא צריכים להיחשב ממצה. יכולים להיות מאומתים על ידי להיטי השימוש בטכניקות להערכת היבטים שונים של תפקוד המיטוכונדריה לצריכת חמצן דוגמא, ג elegans זנים עם מיטוכונדריה GFP להביע, כתמים לפוטנציאל קרום המיטוכונדריה ו / או מדידות ROS. 16,33,34 המשמעות הגדולה ביותר של המתודולוגיה היא להיות אמצעי לסינון מספר רב של תרכובות ו / או תנאים ברמת האורגניזם רב-תאית, וחשוב מכך כדי להיות מסוגל לנצל את הנְהִילוּת הגנטית דואר של ג elegans לחקור מנגנוני פעולה. הטכניקה עשויה לעזור להאיץ ולמצוא נתיבים חדשים לגילוי של תרכובות ויעדים מעניינים. זה שחזה כי השילוב של החיישן עם רקע גנטי הקשורים למחלות בבני אדם להקרנה של ספריות מתחם בהקשר רלוונטי מחלה יש הרבה מה להציע.

המטרה הכוללת של הליך זה היא הכימות המהיר של מצב האנרגיה של ג elegans in vivo עם נוף לשימוש זה כנקודת סיום בהקרנת מתחם. הרציונל מבוסס על הביטוי המהונדס של לוציפראז הגחלילית בג נמטודות elegans 1-3 באמצעות פלסמיד (1 pSLGCV <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> האנזים בלוציפראז הוא התמזגו לGFP חלבון פלואורסצנטי הירוק ובא לידי ביטוי בכל מקום וconstitutively בציטופלסמה (peroxisome לוציפראז מיקוד אות הוסר). זה מוביל לפליטת אור כאשר luciferin המצע מסופק אקסוגני. כתולעת היא שקופה, אור ניתן למדוד בluminometer כיחידות יחסי אור (RLU). דלקי ATP סלולריים תגובת פליטת אור וזמינותו קובעים את רמות האור מיוצרות. כתוצאה מכך, luminometry מציע convenienלא אומר להערכת רמות ה- ATP היחסית ועל ידי פונקציה של המיטוכונדריה הרחבה, מאז ייצור ATP מתרחש בעיקר במיטוכונדריה. קשר בין רמות תפקוד ופליטת האור של המיטוכונדריה כבר הוכיח בעבר באמצעות ההשתקה של גני המיטוכונדריה הובלת אלקטרונים שרשרת ונלווית תפוקת אור מופחתת. 1 זני פליטת אור שנוצרו היו מיועדים PE254 (feIs4) ו PE255 (feIs5) 1 (ראה רשימת חומרים) וניתן להשתמש בם לסירוגין. 3 מספר המחקרים מנוצל זני חיישן אלה לדווח על רמות ה- ATP הסלולריות in vivo לאחר חשיפה לכימיקלים xenobiotic שונים כגון אזיד הנתרן 1, 2 קדמיום, ביוב בוצת תמצית 3, 5&#39;-fluoro-2-deoxyuridine 6, וnitrosamine טבק ספציפי 7. גם הזנים היו שימושיים כדי לפקח על השפעות של חשיפה לקרינת אולטרה סגולה C <sעד&gt; 8 ואת ההשפעות של שיבוש תפקוד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה. 1.9 גרסה מוקדמת של חיישן הארה המבטא את הגן בלוציפראז ללא היתוך GFP (PE39) שימשו גם בחקירת השפעות של מתכות כבדות ושל דרכי הנשימה . Uncoupler 10 זני PE254 וPE255 לשאת לוציפראז: הקרינה היתוך וGFP GFP הוצגה להגדיל באופן יחסי עם מסת נמטודות, מציע אמצעי נוח לנורמליזציה של ערכי הארה 6,9 ההשפעות של סכום ההפרש של תולעים בכל טוב יכולות להיות גם. נלקח בחשבון על ידי כולל משכפל טכני מרובה בassay (מינימום של 5 בארות לכל מצב). 3 הפרוטוקול מציע את האפשרות של ניטור vivo של רמות אנרגיה (בניגוד ליותר מבחינה טכנית מייגע במבחנה קביעות ATP) מאפשר הקרנת מתחם ולמקם מחדש בהקשר הפיזיולוגי של כל muהאורגניזם lticellular. ההליך יכול להתארך למגוון של רקע גנטי על ידי חציית transgene המשולב chromosomally לזנים מוטנטים זמינים ו / או על ידי השתקת גנים על ידי התערבות RNA; כך, תוך ניצול מלא של ג elegans כאורגניזם מודל. השיטה אמורה לעזור להפחית כישלון בשלב מאוחר של מועמדי סמים בשל רעילות המיטוכונדריה ולתרום תרומה לצמצום ניסויים בבעלי חיים גבוהים יותר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

נציגי תוצאות כדי להמחיש את השיטה התקבלו לrotenone (איור 1), paraquat (איור 2), oxaloacetate (איור 3), ו 4 תרכובות שהרימו מעכבים כגחלילית בלוציפראז במהלך ההקרנה של ספריית תרופת 13 (איור 4). החשיפה לסמים החלה בשלב L4 בכל המקרים, אבל ניסויי חשיפת paraquat היו התחילו ב 41 שעות לאחר האוכל סיפק ראשון לנמטודות לעומת 45-46 שעות לתרכובות האחרות. הפרוטוקול מאפשר למידה של גמישות בבחירת הזמן לחניכה של החשיפה לסמים ואורך החשיפה. צריכים להיות דבקות פעמים עם זאת, למטרות הקרנה, מוגדרים נבחרו פעם אחת, לשחזור בין ניסויים. נקודות קצה יש למדוד על ידי זמן התפתחותי 66-67 שעות על מנת למנוע הטלת ביצים נרחבת ובקיעה של צאצאים בבארות. הנחיות לתזמונים מסופקות בTתוכל 1. Rotenone, מורכב המיטוכונדריה אני מעכב, הופחת פליטת אור לאחר שני חשיפות קצרות יחסית (שעה 2) ועוד (24 שעות) לטווח של ריכוזים (איור 1). במקרה זה, אין מדידות GFP נלקחו, אך מספר החזרות טכניות בשימוש (n = 6) מספיק כדי לאזן את כל הבדלים במספרי תולעת בין בארות 3. חשיפת 24 שעות היא חלון של זמן שבו נמטודות לגדול, ופיתוח איטי יותר כתוצאה מעיכוב אני מורכב היה צפוי לתרום לירידה בפליטת אור. זו אושרה על ידי תצפית ויזואלית תחת stereoscope עם התפתחות מאוחרת ראתה, במיוחד בריכוזים של 20 מיקרומטר ומעלה; בנוסף כמה קטלני היה שם לב מ -40 מיקרומטר (תצפיות איכותיות לא לכמת). לא קטלני נצפה לאחר חשיפת 2 שעות אבל השפעות על תנועת תולעת נראו. ירידה חדה בפליטת אור ביחס להביא עלינו כיבוש בקרותrred בריכוז הנמוך ביותר של 2.5 מיקרומטר rotenone נבדק, שלתופעות לא מזוהות בקלות על ידי תצפית ויזואלית מהירה ב -2 חשיפת HR. ירידה בפליטת אור זה עולה בקנה אחד עם ATP הסלולרי מופחת. עיכוב מקסימאלי הושג עם הריכוז הנמוך ביותר של rotenone משמש (2.5 מיקרומטר) מצביע על כך שצריכים להתבצע בכל ניסויים הבאים במיוחד מיקוד rotenone בין 0 ל 5 מיקרומטר [טווח הריכוז 0-160 מיקרומטר נבחר כחלק מהשוואה עם תרופות אחרות תחילה זוהה כבעלי השפעה משמעותית על 10 מיקרומטר (שיפורסם במקום אחר)]. Paraquat קוטל העשבים משפיע על תפקוד המיטוכונדריה דרך גידול של מיני חמצן תגובתי. הנה, אנחנו מדגימים את השפעתה על פליטת אור של ג PE254 מתח elegans לאחר חשיפה למגוון רחב של ריכוזים למשך 24 שעות (איור 2). כזן נושא לוק :: היתוך GFP, הקרינה GFP הייתה also נמדד כאמצעי לנורמליזציה. 6,9 Paraquat ירד פליטת אור, הקרינה GFP ופליטת אור מנורמלת באופן משמעותי. מבחן פוסט הוק-Dunnet הצביע על כך שהריכוזים של paraquat עם הבדלים משמעותיים ביחס לשליטה ברכב היו 4 ו -8 מ&quot;מ לפליטת אור ופליטת אור מנורמל, כמו גם 2 מ&quot;מ לפליטת אור מנורמל. הריכוז רק הפחתת הקרינה GFP באופן משמעותי היה 8 מ&quot;מ, ריכוז שבו השפעות הצמיחה והתולעת המתה מדי פעם נראו (תצפיות איכותיות). הירידה בפליטת אור (ופליטת אור מנורמלת) הייתה גדולה יותר מזה של הקרינה, עולה בקנה אחד עם הירידה בתפקוד והשפעות על ייצור ATP במיטוכונדריה. Oxaloacetate ביניים מעגל חומצה הציטרית נבדק על ג PE254 מתח elegans בריכוז אחד של 8 מ&quot;מ, הוביל לעלייה בפליטת אור (איור 3). לא לזרוח GFPמדידות NCE התקבלו או תצפית חזותית נוספת שביצעה; עם זאת, כגון תגובה לריכוז יחיד הייתה זוכה לחשיפה נוספת מאשרות לטווח של ריכוזים, ותצפיות מפורטות יותר של השפעות. שיפור של פליטת אור על ידי המתחם הזה הוא לא מפתיע כפי שהוא יכול להיות הניח להוביל לפעילות גדולה יותר של מעגל החומצה הציטרית, עם ייצור סופו של דבר גדול יותר של ה- ATP (בכל זאת זה יהיה רצוי כדי לשלוט על כל השפעות על רמות לוציפראז על ידי הערכת הקרינה GFP בניסויים הבאים). ערכות נתונים oxaloacetate מוצגות חושפים את מידת ההשתנות בתגובה ראתה בניסויים מבוססים לוציפראז. מניסיוננו שונות זו תכונה של מערכת הבדיקה במיוחד לתנאי חשיפה פחות מזיקים. DDD00001434 התרכובות מעכבות גחלילית בלוציפראז, DDD0001477, DDD00000635 וDDD00023047 נבדקו הן במבחנה על ידי מסתכל על השפעות על puאנזים אחוז האימה וin vivo באמצעות ג לוק elegans: GFP להביע מתח. לא היו שום ראיות לכך שכל אחד מהתרכובות שנבדקו גרם למות נמטודות בתנאי החשיפה. כל 4 התרכובות השפיעו על הפעילות בלוציפראז במבחנה בריכוזים שנבדק 2 25 ו 100 מיקרומטר (איור 4 א). DDD00001434 נהרג הפעילות של לוציפראז המטוהר כמעט לחלוטין, אשר סיפק הצדקה אמינה לירידה הגדולה בin vivo פליטת אור (איור 4). אמנם, במבחנה ובמבחני vivo לא להשוואה ישירה, התגובה לDDD00023047 הייתה דומה בשני מבחני. DDD0001477 וDDD00000635 גרמו לירידה גדולה יותר בvivo מאשר במבחנה. תרכובות אלה נמסרו לתולעים חיים 22 שעות לפני מצע luciferin, ותוצאות עשויות לשקף שהם לא בקלות שנעקרו מהאתר הפעיל לוציפראז כאשר luciferin הפך available. לחלופין, DDD0001477 וDDD00000635 עלול להיות השפעה נוספת על רמות ה- ATP סלולריות. זה היה צריך להיות מוערך על ידי אמצעים שאינם כרוכים בלוציפראז גחלילית. של פתק היה השיפור החזק של אות ה- GFP בתולעים חיים החשופים למתחם DDD00000635. זה יידון בהמשך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> איור 1. מורכב המיטוכונדריה אני מעכב rotenone ירד מעמד האנרגיה של ג elegans כפי שנמדד על ידי פליטת אור של PE254 מתח. תולעי שלב מסונכרן L4 (45-46 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשף ל0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ו -160 מיקרומטר rotenone בDMSO 1% ל -2 שעה (קצרה) או 24 שעות (חשיפה ארוכה) קריאות קודמות של פליטת אור בהתאמה וב48 69 שעות של פיתוח תולעת לאחר סיפק מזון. פליטת אור (יחידות אור יחידה יחסית, RLU) באו לידי ביטוי כאחוז מהרכב (1% DMSערכי O). ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני בכל ריכוז rotenone (n = 6). כל הריכוזים שנבדקו הביאו הבדל מאוד משמעותי מבחינה סטטיסטית ביחס לשליטה ברכב (p &lt;0.001). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> איור 2. paraquat לחץ חמצוני ירד מעמד האנרגיה של ג PE254 elegans המתח באופן תלוי ריכוז (שנמדד על ידי פליטת אור). תולעים מסונכרן L4 שלב (לנוחות במקרה זה ב 41 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשף ל0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 או 8 paraquat מ&quot;מ עבור 24 שעות. הקרינה GFP (יחידות יחידה יחסית הקרינה, RFU) שימשה כדי לנרמל את נתוני פליטת אור (יחידת RLU), שני נקודות הקצה שהושגו בפיתוח משאבי אנוש 65. הנתונים באים לידי ביטוי כאחוז מפקדים (1% DMSO). ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני(N = 5 לריכוזים שונים; n = 18 עבור פקדים). כיוון אחד ANOVA: *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> איור 3. oxaloacetate ביניים מעגל חומצה הציטרית (8 מ&quot;מ) משופר פליטת אור של ג PE254 elegans מתח. תולעי שלב מסונכרן L4 (45-46 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשפו למוכנים טרי 8 oxaloacetate מ&quot;מ במשך 18 שעות ± 30 דקות. פליטת אור (RLU יחידה) הייתה לקרוא בזמן ההתפתחותי של שעות 63.5 שעות ± 1 ובאה לידי ביטוי כאחוז מהשליטה ברכב (DDH 2 O). עמודות שונות מייצגות ערכות נתונים שונות של 8 חזרות טכניות הוקצו 96 צלחות גם שונות בתוך אותו הניסוי. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 8). 2 דרך-ANOVA עם &#39;קבע&#39; ו &#39;ריכוז&#39; כגורמים: ̵6; &#39;p&gt; 0.05,&#39; סט עמ הריכוז &#39;&lt;0.001 וטווח האינטראקציה p&gt; 0.05. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> איור 4. בדיקה של תגובות ל4 תרכובות מספריית דנדי גילוי תרופות מתחם 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 וC4: DDD00023047) עם פעילות מעכבת ידועה על הארה לוציפראז גחלילית. (א) השפעה של תרכובות בפעילות של לוציפראז גחלילית מטוהר (נמדד כיחידות אור, RLU), מבוטא באחוזים של שליטה ברכב. ערכת CLSII פליטת אור ATP (רוש, מנהיים, גרמניה) שימשה על פי הוראות עם אותה הכמות של אנזים בלוציפראז aliquoted לבארות (96-W לבןell צלחות microtiter). ATP סופק בריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו1 μl של מתחם (ריכוז סופי הצביע) או DMSO (1%) נוספו. אות הארה שולבה במשך 10 שניות. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 4). ניתוח: כיוון אחד ANOVA; * P &lt;0.05 או *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב. הבדלים בין 25 ל 100 מיקרומטר משמעותיים ביותר עבור C1 (DDD00001434; p &lt;0.001), ומשמעותי עבור C2 ו- C3 (בהתאמה DDD0001477 וDDD00000635; p &lt;0.05). (ב) בvivo מדידות של פליטת אור, פליטת אור מנורמלת לקרינת GFP ו הקרינה GFP של ג PE254 elegans מתח בזמן התפתחותי 67 שעות לאחר חשיפה לתרכובות מבחן במשך 22 שעות. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 8). ניתוח סטטיסטי (דרך-ANOVA אחת) בוצעה על הנתונים אספו מ3 ערכות נתונים (3 xn = 8). * P &lt;0.05 או *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב בהתאמה. בידולCES בין 25 ל 100 מיקרומטר רק מובהק סטטיסטי (p &lt;0.05) לפליטת אור מנורמלת בעקבות החשיפה לC4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שעה ביום </td><td> יום 1 </td><td> יום 2 </td><td> יום 3 </td><td> יום 4 </td><td> יום 5 </td><td> יום 6 </td><td> יום 7 </td><td> יום 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 4 </td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><tד&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> שלב 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> סקירת טבלת 1. צעדי פרוטוקול להתבצע בכל יום של ניסויי נמטודות (סעיף 3) והציעה תזמונים.

Watch this Scientific Journal Video about A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Screenable<em&gt; In vivo</em&gt; Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K Views.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Video: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.