אנו מודים תג&#39;ר א &#39;וב&#39; שיאה של שיתוף הפעולה המתמשך שלהם, לצורך מתן רקמת הריאה למטרות הדגמה כאן. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק HL-092961. עבודה זו בוצעה כחלק במרכז מערכות ננומטריות (CNS), חבר של רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומיות, אשר נתמך על ידי קרן המדע הלאומית תחת הפרס NSF ECS-0335765. CNS היא חלק מהפקולטה למדעים ואמנויות באוניברסיטת הרווארד.

1. רקמת הריאה ברצועת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת ריאות הוא תואם מאוד קשה לחתוך לרצועות לאפיון AFM. Transiently כדי לייצב את מבנה הריאות לחיתוך, לנפח את הריאות עכבר מבודד intratracheally עם משקל 50 מ&quot;ל / ק&quot;ג גוף נמוך של 2% ג&#39;ל נקודת agarose (שהוכנו PBS) חימם עד 37 ° C. עניבה את קנה הנשימה מגניב לריאות מנופח באמבט של PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. Agarose יהיה ג&#39;ל מתקשח airspaces בעדינות כדי לייצב את מבנה הריאות במהלך ההפסקה הזו 5. ריכוזים גבוהים יותר agarose, 3-4%, כלומר ניתן להשתמש כדי לשפר עוד יותר את ייצוב לחיתוך רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את agarose מיוצב רקמת הריאה עכבר עם סכין או להב סכין המנתחים לרצועות של 5 מ&quot;מ 5 x באורך ורוחב של 400 מיקרומטר עובי, ולאחר מכן לשטוף את רצועות באמבטיה PBS מראש לחמם 37 ° C באמצעות 100 מ&quot;ל כוס זכוכית על צלחת ספסל העליונה מחומם ומערבבים במשך 5 דקות להסיר agarose שיורית. כדי לא לכלול דרכי הנשימה וכלי גדול, חתוך לרצועות subpleural מאזורים רחוקים העיקרית גזע הסמפונות. אם דרכי הנשימה וכלי גדולים להיות צילמו, לחתוך רצועות של רקמת הריאה הפרוקסימלי יותר העיקרית גזע הסמפונות. </li></ol> 2. AFM Microindentation ו דימות פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד תחומי עניין microindentation AFM, רקמה ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ לעומת שלב, או immunostained ו דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור immunostaining, לחסום רצועות רקמה עם 5% נסיוב ממקור של הנוגדן משני הרצויה (PBS) עבור 2 שעות ללא קיבוע permeabilization או בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רצועת רקמת עם נוגדן ראשוני מתאים (למשל ארנב נגד קולגן אני לדמיין קולגן ביניים (1:250 דילול), ארנבת אנטי laminin (1:250 דילול) כדי להמחיש קרום במרתף) בבאר צלחת 12-באר על הנדנדה עם רעד עדין במשך שעה 1, לשטוף מדגם 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם PBS, ואחריו נוגדנים משני המתאים מצומדות לתייג ניאון (למשל אלקסה פלואוריד 546 נגד ארנב עז נוגדנים משני (דילול 1:250)) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רצועות רקמה נרחב עם PBS ולאחסן PBS ב -4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני אפיון AFM, לצרף את רצועת רקמות coverslip 15 מ&quot;מ פולי-L-ליזין מצופה על ידי הרמת coverslip מלמטה הרקמה צף, מוודא את רצועת רקמת מתפשט באופן שווה על פני השטח coverslip, במידת הצורך, כריך את הרצועה עם נקי שנייה, ללא ציפוי coverslip ולהפעיל לחץ מתון כדי לסייע עם קובץ מצורף רקמות coverslip poly-L-ליזין מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול מערכת AFM הבאים ההוראה של ייצור מיד לפני כל סיבוב של ניסויים microindentation. קבע שני פרמטרים קריטיים: 1) האביב שלוחה קבוע בשיטה תרמית תנודות באוויר 6; ו, 2) את הרגישות סטיה שלוחה, המהווה פרמטר המשמש הסולם אות פלט photodiode אל המרחק בפועל שלוחה סטיה, Δd. כיול רגישות סטיה ידי השגת עקומת תקן כוח תזוזה ב PBS בשקופית זכוכית נקי ואז לחשב את השיפוע של עקומת כוח העקירה (Fig.1B). במדידה עקירה בכוח את העיקול, קצה AFM מורחב לקראת ואסף מפני השטח מדגם במיקום יחיד (ללא rastering בכיוונים XY), עם סטיה של שלוחה, Δd, פיקוח כפונקציה של עקירה קצה, Δz . </li></ol> אנו ממליצים להשתמש סיליקון ניטריד שלוחה משולש עם 5 מיקרומטר קוטר בורוסיליקט כדורי קצה (Novascan). באמצעות בדיקות AFM עם קפיץ קבוע של 0.06 N / m, יש לנו מאופיין מכנית חומרים רכים עם moduli גזירה פורש 100 עד 50,000 אבא. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את המשטח התחתון של coverslip המדגם בנייר טישו, להדק אותו להחליק כוס שמן רגיל עם ואקום, הר שקופיות הזכוכית על הבמה מדגם AFM, לכסות את הרקמה עם 500 μl PBS (טמפרטורת החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקרוסקופ לצפייה עין חלקים ליישר את קצה AFM במרכז שדה הראייה באמצעות התאמת הבמה מדגם מיקרוסקופ. בחר שטח של הריבית על הרקמה ידי הזזת הבמה מדגם AFM, ולאחר מכן לעבור מצלמת CCD צופה לרשום בניגוד לשלב תמונה ו / או תמונות פלואורסצנציה של הרקמה, כרצונכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו פעולה סטנדרטי AFM האירוסין ידי הזזת קצה AFM לאט כלפי מטה עד שהוא נמצא בקשר עם המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיון מדויק AFM microindentation של דגימות רך דורש בעומק הזחה קטנים, כדי למנוע זנים מקומיים גדולים לפסול את המודל הרץ המשמשים לחישוב מודולוס אלסטיות. כדי למנוע זנים גדולים, לבצע הזחה במצב ההדק ידי קביעת מקסימום שלוחה סטיה (נקודת ההדק) עד 500 ננומטר. זה גבול הסטייה יהיה לרסן אתכוח הכניסה המקסימלי פחות מ -30 NN (F = אביב * שלוחה תזוזה מתמדת, או מקסימום F = 0.06 NN / ננומטר * 500 ננומטר = 30 NN). </li></ol> מהירות הכניסה יש לבחור להיות איטי מספיק כדי לחקור אלסטי ולא מאפיינים viscoelastic המדגם רכה 7. טווח מהירות 2-20 מיקרומטר לשניה מתאים רקמת הריאה. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידה אחת מתוך שטח של עניין, הזיזו את החללית AFM למיקום עניין לבצע הזחה אחת לאסוף עקומת תקן כוח תזוזה (החללית נעה רק בכיוון-Z בלי סריקה XY). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיפוי אוטומטי של אזור של עניין, לעבור למצב כוח-Map, בחר את גודל סריקה נקודות דגימה בתוך האזור הנבחר. במצב כוח, מפה, rasters קצה AFM פני השטח מדגם בין תנועות הכניסה, וגובה הפרט בכוח עקירה עקומות בכל נקודה בתוך רשת מדגם מוגדר. נקודות דיגום עוד יספק רזולוציה מרחבית גבוהה אבל להאריך את משך הזמן הנדרש למיפוי. מצאנו את זה מעשי להשתמש 16 x 16 רשת מדגם למפות 80 x 80 מיקרומטר האזור במהירות הכניסה של 20 מיקרומטר לשניה, כך ניתן להשלים ~ 10 דקות. </li></ol> 3. AFM הפקת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את מודול יאנג, להתאים את עקומת כוח תזוזה מודל הכניסה הרץ כדורית באמצעות הריבועים הפחותים שאינו ליניארי הולם מתעקל 8 (תמונה 1, ג): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> היכן F = k ג * Δ ד, הוא הכוח לכופף את שלוחה, k c הוא האביב שלוחה קבועה, R הוא קצה רדיוס כדור, δ = Δ z - Δ ד היא הכניסה ואת υ הוא פואסון של מדגם תפעוליות (υ = 0.4 על רקמת הריאה 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את איכות התאים, לחשב את הערך SSR, או סכום של ריבועים של ההבדל בין הנתונים לבין ערכים מתאימים, במהלך הולם שאינו ליניארי את העיקול. ביטול מדידות אמין או בלתי לפירוש על ידי השלכת נתונים מ עקומות &quot;רע&quot; עם ערכים SSR גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, להמיר אלסטי מודול (E) כדי גזירה מודולוס (G), באמצעות הקשר E = 2 x (1 + υ) x ג&#39;כדי להמחיש דפוסי המרחבי של נוקשות שנאספו במצב כוח, מפה, העלילה נתונים מודול בתוך קונטור מפות (לדוגמא ברשת 16 x 16 מדגם המשתרע על 80 x 80 מיקרומטר שטח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבד כמות גדולה של נתונים עקומת כוח, אלגוריתם מנהג עשוי להיות כתובה באופן אוטומטי להתאים בכוח עקירה עקומות, תמצית moduli, ו / או elastographs העלילה באמצעות אותם הליכים ופרמטרים כפי שמתואר 3.2 ו -3.3 (כגון Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 (א) סכמטי של microindentation AFM מדגם רך על מצע קשיח באמצעות בדיקה כדורית (מחדש עם אישור Dimitriadis א, et al. 2002 Biophys J 8). (ב) נציג בכוח עקירה עקומת שנאספו זכוכית שקופית נקי PBS לקבוע סטיה רגישות שלוחה. (ג) כוח תזוזה עקומות נציג שנאספו (אדום) דגימות רך (כחול) ונוקשה מראה את הפרמטרים המתאימים של (A). 4. נציג תוצאות: איור 2 א מראה parenchyma הריאה מחוברת רצועה על coverslip poly-L-ליזין מצופה PBS עם בדיקה AFM במקום ישירות מעל אזור של אינטרס ומוכן מיפוי microindentation. איור 2B מראה כי ברקמות לחתוך כראוי מוכתם, ארכיטקטורה מכתשיים של הריאה parenchyma נשמר היטב, כפי שנצפה על ידי צביעת immunofluorescent עבור laminin קרום מרכיב במרתף ללא קיבוע או permeabilization. איור 2 CD להראות מכתים immunofluorescent עבור קולגן אני מבולבל בריאות טריים שנקטפו מן העכברים שטופלו בעבר עם PBS (איור 2 ג), או שטופלו bleomycin (איור 2 ד) כדי לגרום סיסטיק 10. איור 3A מראה כוח תזוזה מדגם מגרשים המתקבל microindentation AFM. עם הכוח ליישם אותו, AFM הטיפ יוצרת הזחה גדולה על אזור רך (קו כחול), וכתוצאה מכך יחסית עקומה &quot;שטוח&quot; עקירה בכוח לעומת חריץ קטן &quot;תלול&quot; עקירה בכוח עקומת עבור אזור נוקשה ( הקו האדום). על מנת לקבל את עקומות הכוח נקי, לאחר הכניסה לכל קצה AFM צריך להיות חזר בו לחלוטין מפני השטח מדגם ללא קשר לפני הכניסה הבאה. זו מדינה חופשית מגע מתאים באזור השטוח של העקומה ב איור 3A, שם בקצה מתרגמת ללא סטיה שלוחה. איור 3 ב מציג את עקומת שקר טיפוסי ללא באזור שטוח אשר מתרחשת כאשר קצה לא חזר בו לחלוטין מפני השטח מדגם (מדגם רך לדוגמאttaches אל קצה) כך שלא ניתן לקבוע את נקודת מגע. אם קצה לכוד לגמרי מדגם רך, העקום עשוי להיראות כפי שמוצג באיור 3C, ללא הטיה ברורה אבל רעש קטן. איור 4 מראה נתונים מודולוס גזירה מופק בכוח עקירה עקומות מוצג מרחבית כמו מפות נוקשות (elastographs), שם קשקשים בצבע עם מודולוס גזירה. Elastographs להדגים הבדלים ניכרים בטווח והפצה של מודולוס גזירה רקמה נורמלית (איור 4 א) ו fibrotic (איור 4B) ריאות parenchyma, ווריאציות מרחבית גדולה מודולוס גזירה, במיוחד בתוך המדגם ריאות fibrotic. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2.) A (לעומת שלב מיקרוסקופ מראה בדיקה AFM מעל רצועת ריאות עכבר parenchyma. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (ב) Immunostaining של laminin ברקמת הריאה עכבר נורמלי מראה את ארכיטקטורה מכתשיים של parenchyma ריאות נורמליים. קופסה לבנה מציין מיפוי טיפוסי 80-by-80μm אזור אלסטיות. בר קנה מידה: 20 מיקרומטר. (C ו-D) Immunostaining של קולגן אני בתוך מלוחים (C) bleomycin (ד &#39;) שטופלו ריאות עכבר parenchyma. סולם ברים, 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. (א) נציג לפירוש בכוח עקירה עקומות שנאספו מלוחים (כחול) bleomycin שטופלו (אדום) עכבר ריאות parenchyma, בהתאמה. הקווים השחורים הם בכושר הטוב ביותר הנובע המודל הרץ כדורי מסומנים עם המקביל שלהם מחושב של יאנג moduli. (B, C) נציג האו&quot;ם לפירוש בכוח עקירה עקומות. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. Elastographs נציג שנאספו מלוחים (א) ו bleomycin שטופלו (ב) ריאות parenchyma העכבר. ברים צבע מצביעים מודולוס גזירה kilopascals. תוויות ציר עולה בקנה מידה מרחבי מיקרומטר. בר קנה מידה: 20 מיקרומטר

<ol>
	<li>Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+flexibility+regulates+growth+and+apoptosis+of+normal+but+not+transformed+cells.">Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-C1350 (2000).</li><li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening.">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+and+smooth+muscle+Ca(2+)+signaling+in+lung+slices+from+different+mouse+strains.">Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains.</a> J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).</li><li>Thundat, T., Warmack, R. J., Chen, G. Y., Allison, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+and+ambient-induced+deflections+of+scanning+force+microscope+cantilevers.">Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers.</a> Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).</li><li>Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Kas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+probe-based+frequency-dependent+microrheology+of+polymer+gels+and+biological+cells.">Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells.</a> Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).</li><li>Butler, J. P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., Takishima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poissons'+ratio+of+lung+parenchyma+and+parenchymal+interaction+with+bronchi.">Poissons' ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi.</a> Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).</li><li>Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+amplification+of+fibrosis+through+matrix+stiffening+and+COX-2+suppression.">Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression.</a> J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).</li><li>Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., Ludwig, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+and+tissue+viscoelasticity+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis.+Temporal+aspects.">Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects.</a> Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).</li><li>Dolhnikoff, M., Mauad, T., Ludwig, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+oscillatory+mechanics+of+rat+lung+parenchyma+in+bleomycin-induced+fibrosis.">Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).</li><li>Rehfeldt, F., Engler, A. J., Eckhardt, A., Ahmed, F., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+responses+to+the+mechanochemical+microenvironment--implications+for+regenerative+medicine+and+drug+delivery.">Cell responses to the mechanochemical microenvironment--implications for regenerative medicine and drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).</li><li>Berry, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+injection+after+myocardial+infarction+improves+myocardial+compliance.">Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, 2196-2203 (2006).</li><li>Azeloglu, E. U., Bhattacharya, J., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+elastography+reveals+phenotypic+differences+in+alveolar+cell+stiffness.">Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness.</a> J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).</li><li>Wagh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+elasticity+measured+in+epithelial+cells+migrating+at+a+wound+edge+using+atomic+force+microscopy.">Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 54-60 (2008).</li><li>Martinez, F. J., Flaherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+function+testing+in+idiopathic+interstitial+pneumonias.">Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).</li><li>Cavalcante, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+collagen+and+proteoglycans:+implications+for+the+stability+of+lung+tissue.">Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue.</a> J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).</li><li>Hajji, M. A., Wilson, T. A., Lai-Fook, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+measurements+of+shear+modulus+and+pleural+membrane+tension+of+the+lung.">Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung.</a> J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).</li><li>Lai-Fook, S. J., Wilson, T. A., Hyatt, R. E., Rodarte, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+constants+of+inflated+lobes+of+dog+lungs.">Elastic constants of inflated lobes of dog lungs.</a> J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).</li><li>Azeloglu, E. U., Kaushik, G., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+hybrid+computational+model+of+AFM+indentation+for+analysis+of+mechanically+heterogeneous+samples.">Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4273-4276 (2009).</li><li>A-Hassan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy.">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אפיון מכני של רקמת הריאה באמצעות AFM microindentation מציע ברזולוציה מרחבית חסרת תקדים (איור 4), המספק נקודת מבט ייחודית על וריאציות microscale ב קשיחות הרקמה. כדוגמה השירות שלה, הקודם מאקרו בקנה מידה מדידות רצועות רקמה נורמלית fibrotic ריאות הצביעו על עלייה משוער 2-3 של פי elastance עם סיסטיק 11,12. לעומת זאת, microindentation AFM מגלה כי התקשות רקמות הוא מקומי מאוד, עם אזורים מסוימים מציג עד ~ מגדיל פי 30 ב מודולוס גזירה מעל החציון שנצפתה רקמת הריאה נורמלי 10. כמו נוקשות מטריצה ​​כיום ידוע באופן ביקורתי להשפיע על תפקוד התאים, המדידות הללו המקומית לספק פרמטרים שלא יסולא בפז כדי לשפר את biofidelity המחקר התא התרבות של תאים הריאות. כמה עולות סוגיות מעשיות לשימוש רצועות דקות של רקמת הריאות. משטחים של רצועות אינם שטוח לחלוטין, כמו פרופיל רקמות בעקבות הארכיטקטורה של alveoli הבסיסית. מערכת AFM באופן אוטומטי את מיקום קצה בכיוון-Z במהלך הכניסה כאשר פני השטח מדגם וריאציה גובה קטן מ -15 מיקרומטר כדי לסייע להתגבר על האתגר הזה. המדידות נעשות בטמפרטורת החדר, לא 37 ° C, ולכן סטיות של תכונות מכניות הנגרמת על ידי וריאציה זו בטמפרטורה לא ניתן להעריך, אם כי הם יהיו צפויים להיות קלים. השפעת הארכיטקטורה שבבסיס קיר מכתשיים על תכונות מכניות נצפתה קשה לקבוע עם ההגדרה הנוכחית במיקרוסקופ אור. למשל, רצוי לקבוע אם הקירות מכתשיים התערוכה אנאיזוטרופיה תכונות מכניות שונות כאשר מסוכסך בכיוונים מיושר עם או רוחבי למישור הקיר. עם זאת, דגימות הנוכחי עבים מערכת הדמיה אין יכולות 3D, ולכן לא ניתן לקבוע את הכיוון המקומית קיר מכתשיים בכל נקודת מגע. לבסוף, את השפעתם של מרכיבים הסלולר על תכונות מכניות נמדד עדיין לא הובהר באופן מלא. בכל השיטות המפורטות כאן, המאמצים לא נעשים במפורש להסיר מרכיבים הסלולר של הרקמה. עם זאת, התאים את ההווה על פני השטח זמין עבור הכניסה צפויים להיות בת קיימא לנוכח הזמן שחלף מאז הקציר רקמות הצורך חיתוך הרקמה כדי לקבל גישה alveoli. ניסויים ספציפיים כדי להסיר תאים או לאכלס מחדש מטריצות עם תאים קיימא, ולהעריך את השינויים וכתוצאה מכך קשיחות הרקמה יופיע מוצדקת. מכיוון רקמת מבולבל טרי דרוש מדידות אלה, הזמן שחלף מן הקציר רקמות מדידה צריך להיות ממוזער דגימות צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע שינויים תכונות מכניות. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם בכל פעם רצועות ורקמות מועברים בין המכולות במהלך הכביסה או מכתים כך עיוות נזק מינימלי או מופק. עבור יישום AFM בנוזל, היא צעד חיוני כדי לחתוך את הרקמה כפי שטוחה ככל האפשר לשתק את המדגם על coverslip התומכת. אם זמין, מכונת חתך אוטומטי כגון vibratome או מבצעה רקמה ניתן להשתמש כדי לחתוך פרוסות בעובי אחיד מאוד. חשוב לצרף רצועות רקמה מיד לפני מדידות AFM ולמזער את הזמן שחלף עבור מדידות AFM כמו המדגם יהיה בסופו של דבר להתנתק coverslips. תצפית אחת שימושית כי רצועות גדול להופיע לצרף ביציבות יותר כדי לכסות את תלושי להישאר במקום משכי זמן של PBS מאשר רצועות קטנות יותר. Microindentation AFM ניתן לאפיין דגימות פורש מגוון רחב של אבא 100 עד kPa 50 (גזירה מודולוס) בעת שימוש 0.06 תקן N / שלוחה מ &#39;עם טיפ 5 מיקרומטר קוטר כדורית. טווח זה ניתן להרחיב באמצעות בדיקות עם קבועי קפיץ שונים; בדיקות AFM עם טיפים זכוכית כדורית החל 0.6-12 מיקרומטר קבועים בקוטר האביב החל 0.01-0.58 N / m זמינים מסחרית (לדוגמה Novascan) ו נפוץ 3. עם קצה כדורי 5 מיקרומטר, האזור קשר תיאורטי בין עצה לבין רקמות היא כ 5-9 מיקרומטר 2 עבור הכניסה 400-700 ננומטר (איור 1A). טיפים קטנים יותר או גדול יותר יכול לשמש כדי לספק סולמות קטן או גדול של רזולוציה מרחבית. טיפים פירמידה יש גם בשימוש microindentation AFM 13-16, מתן מגע באזורים קטנים יותר ובכך להגדיל רזולוציה מרחבית במיפוי, אם כי ראוי נתונים מורכב יותר עבור הגיאומטריה טיפ זה. מספר מגבלות לשיטה זו יש לציין. הריאות באופן מסורתי מאופיין מכנית הלא פולשני, למשל באמצעות הלחץ בנפח 17 או ניתוח פונץ הכניסה של הריאות כל 19,20. שיטות פולשנית כמו זה המתואר כאן לשנות את הארכיטקטורה ריאות במובנים חשובים דרך אובדן int אוויר הנוזלerface כי בדרך כלל קיימת הריאות אוויר מילאו את ואובדן להדגיש מראש כי האינפלציה שומרת ריאות חלקית על הרפיה של שרירי הנשימה. מגבלות אלה משותפת לכל המדידות שנעשו רקמת הריאות 18 רצועות. יש לציין, עם זאת, נוקשות החציוני הנמדד parenchyma של רקמת הריאה נורמלי (מודולוס גזירה ~ 0.5kPa) לא שונות באופן מהותי מן אומדנים המבוססים על הכניסה-אגרוף של הריאות שלם בעוצמות מנוחה 19,20. בעוד רקמת הריאה ידוע התערוכה שאינו ליניארי התקשות עם העיוות גדל, לא ניתן לבדוק באופן קפדני אם נכס זה נמשכת עד בקנה מידה מיקרו עם השיטות הננקטות כאן. המודל מניח הרץ ההומוגניות של המדגם. עם זאת, חומרים ביולוגיים ביותר, כולל ריאות parenchyma, הם הטרוגניים יותר ויותר ירידה קשקשים מרחבית. ההטרוגניות של המדגם יכול לגרום חפצים כמו וריאציה של מודול של יאנג, תלוי בעומק הכניסה, כלומר בהתאם השכבה או רכיב זה עיוות. ההטרוגניות במישור xy, יכול להיות מוגבל על ידי בחירה מדוקדקת בגודל המתאים קצה כדוריים בהתאם מיקרו של ביולוגי כפי שהוצע על ידי Dimitriadis EK et al. 8 זה הרבה יותר קשה לחזות או לתקן את השגיאה מודל הרץ בשל חומר ההטרוגניות בכיוון-z. Azeloglu et al. לאחרונה הציע מודל חישובי היברידית לאפיין את תכונות אלסטיות של המצע הטרוגנית עם תכלילים מוטבע בדידים 21. הטכניקה החדשה שלהם מספק פוטנציאל אמצעי כדי לחשב תכונות הכללתם של חומרים הטרוגניים להתגבר על המגבלות של ניתוח Hertzian. המודל מניח הרץ גם התנהגות אלסטית מוחלטת, בעוד חומרים ביולוגיים בדרך כלל להציג תלוי זמן התנהגויות viscoelastic. אפיון viscoelastic מלא של רקמה ניתן להשיג על ידי שינוי מהירויות הכניסה בשימוש. חשוב לציין, בדיקות קודמות מאקרו בקנה מידה מכנית של רקמת הריאה נורמלי fibrotic מדגים תלות תדר חלש של רקמת הריאה תכונות מכניות, ושמירה על ההבדלים בין מאפייני רקמת נורמלי fibrotic מכני על פני תדרים כל נבדק 11. ממצאים אלו ממליצים כי מדידת תכונות מכניות באמצעות מהירות הכניסה יחיד עם AFM לוכדת היבט חיוני של שינויים במאפייני הרקמה מכני שמלווים פיברוזיס. היחס של פואסון של 0.4 עבור רקמת הריאה המשמש עבודה זו היא מן מדידה מאקרוסקופי 9. למרבה הצער, יחס של פואסון על מיקרו בקנה מידה שינויים בתנאי המחלה אינם זמינים בספרות. כפי חלופות E, E / (1-υ 2) או (1-υ 2) / πE (סימלה את k קבוע אלסטי) 22 ניתן לחשב microindentation AFM ודיווח כאשר היחס של פואסון אינו ידוע. עבור רוב biomaterials היחס של פואסון הוא בטווח של 0.4-0.5 בגלל תכולת המים הגבוהה שלהם. בטווח 0.3-0.5, הגורם 1 / (1-υ 2) משתנה רק 1.10-1.33, כך וריאציות סביר ביחס של פואסון להפעיל רק תופעות צנוע על מודול דיווח. הגידול מודולוס גזירה שאנחנו הדוח היחסית רקמות fibrotic אל הרקמות הוא פי כמה גודל, רומז כי השגיאות המשויכות וריאציות של יחס פואסון הם קלים יחסית לשינויים שנצפו תכונות מכניות. האלגוריתם קוד בפועל שיכול לשמש לניתוח נתונים עקירה בכוח כפוף לתנאי היישום הספציפי ואת המאפיינים הבאים של אוכלוסיות מגוונות של עקירה בכוח עקומות. אם ניתוח מתוחכם יותר מעניין, אפשר להתייעץ העבודה של Lin et al. 23. החוקרים ערכו סדרה של אסטרטגיות סינרגיסטי לתוך אלגוריתם מתגבר רבים של סיבוכים אשר מנע בעבר מאמצים כדי להפוך את הרץ הולם של מודלים של נתונים הכניסה. בתחומים אחרים קיימות מספר לפיתוח ניצול נוסף של שיטה זו. במקרים שבהם אחד הוא מעוניין לדמיין את קירות מכתשיים ללא תיוג נוגדן, הן קולגן ואלסטין ו ניתן דמיינו מן האות autofluorescent שלהם בספקטרום הירוק. מצד שני, הדמיה טובה יותר, או באמצעות קטעי רקמה רזה, שיטות הדמיה 3D, או שניהם, יכול לשפר את היכולת לקשר בין הארכיטקטורה הבסיסית רקמות עם תכונות מכניות. בעוד השיטות הקיימות ולאפשר מכתים ויזואליזציה של מרכיבי תאי מטריקס כגון קולגן laminin, מאמצים נוסף יכול להיות מכוון מכתים פני התא סמנים לזיהוי אוכלוסיות תאים ספציפיים כדי לאפיין את microenvironments מכני בקרבת אוכלוסיות כאלה. Alternatively, רקמה ניתן לקצור מעכברים להביע fluorescently-tagged השושלת סמנים או חלבונים ספציפיים בתא להמשיך את אותה המטרה. לבסוף, השיטה המפורטת כאן מופיע גם מתאים לאפיון תכונות אנטומיות אחרות בריאה, כגון כלי אשר לשפץ ב יתר לחץ דם, ואת דרכי הנשימה אשר לשפץ באסתמה. בהתבסס על המצב הנוכחי של פיתוח פוטנציאל שיפור נוסף, microindentation AFM מופיע צפוי להניב תובנות רבות ערך את השינויים רקמות נוקשות שמלווים התקדמות המחלה בריאה, יהיה ללא ספק להיות בעל ערך באפיון שינויים במרחב ובזמן ב קשיחות של מגוון רחב של רקמות רכות אחרות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> AFM הטיפ </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 מיקרון בורוסיליקט חרוז, 0.06 N / m </td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין coverslips </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 מ&quot;מ זכוכית עגול מס &#39;1 </td></tr><tr><td> Agarose, טמפרטורה נמוכה gelling </td><td> סיגמא </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד קולגן אני (RB PAB) נוגדן </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 546 נגד ארנב נוגדן עז </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד Laminin </td><td> סיגמא </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

מטריקס קשיחות מאוד משפיע, צמיחה בידול ותפקוד של תאים חסיד 1-3. בסולם המאקרו את הנוקשות של רקמות ואיברים בגוף האדם תוחלת צווים שונים של גודל 4. הרבה פחות ידוע על כמה קשיחות משתנה מרחבית בתוך רקמות, ומה היקף בקנה מידה נוקשות של שינויים מרחביים הם תהליכי מחלה כי התוצאה שיפוץ רקמות. כדי להבין טוב יותר כיצד שינויים נוקשות מטריקס לתרום הפיזיולוגיה הסלולר מחלה ובריאות, מדידות של רקמות נוקשות שהושגו בקנה מידה מרחבי רלוונטי תאים תושב נדרשים. זה נכון במיוחד עבור הריאות, רקמה תואם מאוד אלסטי בו שיפוץ מטריצה ​​היא תכונה בולטת במחלות כגון יתר לחץ דם אסטמה, אמפיזמה פיברוזיס. כדי לאפיין את הסביבה מכני מקומי של הריאות parenchyma בקנה מידה מרחבי רלוונטי תאים תושב, פיתחנו שיטות כדי למדוד ישירות את המאפיינים אלסטי מקומית של רקמת הריאה טרי Murine באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) microindentation. עם הבחירה המתאימה של AFM Indentor, שלוחה, ועומק הכניסה, שיטות אלה מאפשרים מדידות של מודולוס גזירה מקומית ברקמת במקביל בניגוד שלב ו דימות פלואורסצנטי האזור של עניין. דגימה שיטתית של רצועות ורקמות מספק מפות של מאפייני רקמת מכני החושפים שינויים מרחביים המקומית מודולוס גזירה. מתאמים בין תכונות מכניות תכונות אנטומיות ופתולוגיים הבסיסית להמחיש כיצד קשיחות משתנה עם מטריקס ב סיסטיק בתצהיר. שיטות אלה ניתן להרחיב את רקמות רכות אחרות תהליכי מחלה לחשוף כמה תכונות מכניות רקמות מקומיות שונות ברחבי החלל התקדמות המחלה.

Watch this Scientific Journal Video about Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  Harvard School of Public Health. הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

Video: Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

אפיון תכונות מכניות של דופן התא הראשוני באיברים חיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell behavior such as cell function, differentiation, and motility. However, as these processes are not homogeneous throughout the whole organ, it has become increasingly important to understand changes in the mechanical properties of tissues on the cellular level.
To be able to monitor the stiffening of collagen-rich areas within the liver lobes, this paper presents a protocol for measuring liver tissue elastic moduli with high spatial precision by atomic force microscopy (AFM). AFM is a sensitive method with the potential to characterize local mechanical properties, calculated as Young&#39;s (also referred to as elastic) modulus. AFM coupled with polarization microscopy can be used to specifically locate the areas of fibrosis development based on the birefringence of collagen fibers in tissues. Using the presented protocol, we characterized the stiffness of collagen-rich areas from fibrotic mouse livers and corresponding areas in the livers of control mice.
A prominent increase in the stiffness of collagen-positive areas was observed with fibrosis development. The presented protocol allows for a highly reproducible method of AFM measurement, due to the use of mildly fixed liver tissue, that can be used to further the understanding of disease-initiated changes in local tissue mechanical properties and their effect on the fate of neighboring cells.

We present a protocol to measure the elastic moduli of collagen-rich areas in normal and diseased liver using atomic force microscopy. The simultaneous use of polarization microscopy provides high spatial precision for localizing collagen-rich areas in the liver sections.

מדידת נוקשות הכבד באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם מיקרוסקופיית קיטוב

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

מדידת נוקשות בנימי הרשתית של העכבר ובמטריצה תת-אנדותל

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that diabetes-induced retinal capillary stiffening plays a crucial and previously unrecognized causal role in inflammation-mediated degeneration of retinal capillaries. The increase in retinal capillary stiffness results from the overexpression of lysyl oxidase, an enzyme that crosslinks and stiffens the subendothelial matrix. Since tackling DR at the early stage is expected to prevent or slow down DR progression and associated vision loss, subendothelial matrix, and capillary stiffness represent relevant and novel therapeutic targets for early DR management. Further, direct measurement of retinal capillary stiffness can serve as a crucial preclinical validation step for the development of new imaging techniques for non-invasive assessment of retinal capillary stiffness in animal and human subjects. With this view in mind, we here provide a detailed protocol for the isolation and stiffness measurement of mouse retinal capillaries and subendothelial matrix using atomic force microscopy.

מחבר זרקור: חקירת נוקשות כלי דם ודלקת ברטינופתיה סוכרתית מוקדמת

We recently identified retinal capillary stiffening as a new paradigm for retinal dysfunction associated with diabetes. This protocol elaborates the steps for isolation of mouse retinal capillaries and the subendothelial matrix from retinal endothelial cultures, followed by a description of the stiffness measurement technique using atomic force microscopy.