Biz onların sürekli işbirliği için teşekkür eder, A. Tager ve B. Shea ve gösteri amaçlı kullanılan akciğer dokusunda sağlamak için burada. Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe HL-092.961 Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir. Bu çalışma, NSF ödül ECS-0335765 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen Nano Sistemleri (MSS), Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı üyesi Merkezi&#39;nde yapıldı. MSS, Harvard Üniversitesi Sanat ve Sosyal Bilimler Fakültesi parçasıdır.

1. Akciğer Doku Şeridi&#39;nde Hazırlık <ol><li> Akciğer dokusunun son derece uyumlu ve AFM karakterizasyonu için şeritler halinde kesmek için zor. Geçici, kesim için akciğer yapısı stabilize intratrakeal% 2 düşük jel noktası agaroz (PBS içinde hazırlanmış) 50 ml / kg vücut ağırlığı ile izole fare akciğerlerini şişirmek için 37 ° C&#39;ye kadar ısındı Trakea Kravat ve PBS banyosunda şişirilmiş akciğerler serin, 4 ° C 60 dakika. Agaroz jel ve yavaşça bu aralık 5 sırasında akciğer yapısını stabilize etmek için hava sahasındaki pekiştirmek olacaktır. Yüksek agaroz konsantrasyonları, yani% 3-4, kesim için daha fazla doku istikrar geliştirmek için kullanılıyor olabilir. </li><li> Agaroz stabilize fare akciğer dokusunda Kes, uzunluk ve genişlik 5 x 5 mm ve 400 mm kalınlığında şeritler halinde bir jilet veya neşter bıçağı ile 37 önceden ısıtılmış bir PBS banyosunda şeritler yıkama ° C 100 ml artık agaroz çıkarmak için 5 dakika için bir tezgah üstü ısıtmalı heyecan plaka cam beher. Büyük hava yolları ve damarlar hariç tutmak için, ana kök bronşlarda uzak subplevral bölgelerde şeritler kesin. Hava yolları ve büyük damarların görüntülü edilecekse, ana kök bronşlar daha proksimal akciğer dokusundan şeritler kesin. </li></ol> 2. AFM Microindentation ve Floresans Görüntüleme <ol><li> AFM microindentation ilgi alanları izole etmek için, doku, faz kontrast mikroskobu ile görüntülendi ya da immunohistokimyasal ve floresan mikroskobu ile görünür olabilir. Immün için,% 5 ile 2 saat oda sıcaklığında fiksasyon veya permeabilization olmadan istenilen ikincil antikor kaynağı (PBS) serum doku şeritleri engellemek. </li><li> Uygun primer antikor ile doku şeridi inkübe edin (örneğin Rabbit bazal membran görselleştirmek için interstisyel kollajen (1:250 seyreltme), tavşan anti-laminin (1:250 seyreltme) görselleştirmek için anti-kolajen) 12 plaka iyi 1 saat süreyle hafif sallayarak bir rocker, 1 floresan etiketi (örn. Alexa Fluor 546 keçi anti-tavşan sekonder antikoru (1:250 seyreltme)) konjuge uygun ikincil antikor takip PBS ile her 5 dakika için örnek 3 kere yıkayın oda sıcaklığında saat. </li><li> 4 PBS PBS ve mağaza ile yaygın doku şeritleri yıkayın ° C </li><li> AFM karakterizasyonu hemen önce, poli-L-lisin kaplı 15 mm lamel, kayan doku altında lamel kaldırma doku şeridi lamel yüzeyi üzerinde eşit şekilde yayılır emin yaparak doku şeridi eklemek gerekirse, sandviç şerit ikinci bir temiz, lamel kaplanmamış ve poli-L-lisin kaplı lamel doku eki ile yardımcı olmak için hafif basınç uygulayın. </li><li> Microindentation deneyler, her turdan önce hemen üretimi talimatı aşağıdaki AFM sistemi kalibre edin. Gerçek konsol saptırma mesafe fotodiyot çıkış sinyali ölçekli kullanılan bir parametredir ve 2) konsol sapma duyarlılığı, Δd 1) konsol hava 6 termal dalgalanma yöntemi kullanarak sabit bahar: İki kritik parametreleri belirleyin. Sonra kuvvet-deplasman eğrisi (Fig.1B) eğimi hesaplamak temiz bir cam slayt PBS standart bir kuvvet-deplasman eğrisi elde sapma duyarlılığı kalibre edin. Ucu deplasman, Δz bir fonksiyonu olarak takip konsol saptırma, Δd, kuvvet-deplasman eğrisi ölçüm AFM ucuna doğru ve tek bir yerde (XY yönde rastering olmadan), numune yüzeyinden retrakte . </li></ol> 5 mikron çaplı borosilikat küresel ucu (Novascan) ile bir silisyum nitrür üçgen konsol kullanmanızı öneririz. 0,06 N / m sabit bir yay ile AFM problar kullanılarak, mekanik kayma modülü 50.000 Pa 100 yayılan yumuşak malzemelerin karakterize var. <ol start="6"><li> Kağıt mendil ile örnek lamel alt yüzeyi silin, vakum gres ile standart bir cam slayt tutturmak AFM örnek sahnede cam slayt monte ve 500 ul PBS (oda sıcaklığı) ile doku kapağı. </li><li> Mikroskop numune aşamasında ayarlayarak görüş alanının merkezinde AFM ucu hizalamak için göz parça görüntüleme için mikroskop ayarlayın. AFM örnek sahne hareket ettirerek doku üzerinde bir ilgi alanı seçin, daha sonra istediğiniz gibi, faz kontrast görüntü ve / veya doku floresan görüntüleri kaydetmek için izleme CCD kamera geçmek. </li><li> Numune ile temas halinde olduğu kadar yavaşça aşağıya doğru AFM ucu hareket standart AFM nişan işlemi gerçekleştirin. </li><li> Yumuşak örneklerin doğru AFM microindentation karakterizasyonu elastik modülü hesaplaması için kullanılan Hertz modeli geçersiz küçük girinti derinliklerinde büyük yerel suşların önlemek için gereklidir. Büyük suşlar önlemek için, 500 nm konsol maksimum sapma (tetik noktası) ayarı ile tetikleme modu girinti gerçekleştirin. Bu sapma sınırı dizginlemekmaksimum girinti zorlamak için en az 30 nN (F = konsol bahar sabit * deplasman, veya F max = 0.06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> Girinti hızı, yumuşak örnek 7, elastik yerine viskoelastik özellikleri keşfetmek için yeterince yavaş seçilmelidir . Saniyede 2-20 mikron arasında bir hız aralığında akciğer dokusu için uygundur. <ol start="10"><li> Bir ilgi alanı tek bir ölçüm için, AFM prob ilgi konuma taşımak ve standart bir kuvvet-deplasman eğrisi (prob XY tarama olmadan sadece Z-yönünde hareket) toplamak için tek bir girinti gerçekleştirmek. </li><li> Ilgi çeken bir bölge otomatik haritalama, Kuvvet-Harita moduna geçiş seçilen alanın içinde tarama boyutu ve örnek noktaları seçin. Kuvvet-Harita modu, AFM ucu girinti hareketler arasında örnek bir yüzey üzerinde rasterlar ve tanımlanmış bir örnek ızgara içinde, her noktada bireysel kuvvet-deplasman eğrileri toplar. Daha fazla örnekleme noktaları daha yüksek uzaysal çözünürlüğü sağlamak ancak haritalama için gerekli olan süreyi uzatacaktır. Biz pratik bir girinti hızı ~ 10 dakika içinde tamamlanabilir saniyede 20 mikron, 80 x 80 mikron alan haritaya 16 x 16 örnek ızgara kullanmak bulundu. </li></ol> 3. AFM Data Extraction <ol><li> Young modülü hesaplamak için kuvvet-deplasman eğrisi, en küçük kareler doğrusal olmayan kavisli uydurma 8 (Şekil 1 A, C) kullanarak Hertz küresel girinti modeli uyum: <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> burada F = k c * Δ d, konsol viraj için kuvveti, k c sabit konsol bahar olduğunu, Ar-kürenin ucu yarıçapı. δ = Δ z - Δ d girinti olan ve υ örneklemin Poisson oranı (. υ = 9 akciğer dokusu için 0.4). </li><li> Uyum kalitesini değerlendirmek için, non-lineer eğri uydurma sırasında, SSR değeri veya veri ve fit değerler arasındaki farkın karelerinin toplamı hesaplar. Büyük SSR değerleri ile &quot;kötü&quot; eğrileri verileri atarak, güvenilmez ya da un-yorumlanabilir ölçümleri ortadan kaldırın. </li><li> İstenirse, ilişki kullanılarak, kayma modülü (G) elastik modülü (E) E = 2 x (1 + υ) x G., kontur haritaları çizmek modülü veri Kuvvet-Harita modunda toplanan sertlik mekansal kalıpları görselleştirmek için (16 x 16 örnek ızgara örneğin 80 x 80 mikron alanı kapsayan). </li><li> Büyük miktarda kuvvet eğrisi veri işlemek için özel bir algoritma otomatik olarak 3.2 ve 3.3 (örneğin Matlab) belirtildiği gibi aynı usul ve parametreleri kullanarak kuvvet-deplasman eğrileri, özü modülü ve / veya arsa elastographs uygun için yazılmış olabilir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 (bir) katı bir substrat üzerinde küresel bir prob (Dimitriadis E., ve ark 2002 Biophys J 8 izni ile yayınlanmıştır) kullanarak yumuşak bir örnek AFM microindentation şematik. (B) Temsilcisi kuvvet-deplasman eğrisi PBS içinde temiz bir cam slayt konsol saptırma duyarlılığını belirlemek için toplanır. (C) Temsilcisi kuvvet-deplasman eğrileri (A) karşılık gelen parametreleri gösteren yumuşak (mavi) ve sert (kırmızı) örnekleri toplanmıştır. 4. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 2A, doğrudan ilgi bölge üzerinde yer AFM probu ile PBS poli-L-lisin kaplı lamel bağlı ve microindentation haritalama için hazır bir akciğer parankimi şerit gösterir. Şekil 2B düzgün kesilmiş ve lekeli doku, akciğer parankiminin alveoler mikromimarisini fiksasyon veya permeabilization olmadan bazal membran bileşeni laminin immunofluorescent boyama görüldüğü gibi, korunmuş olduğunu gösterir. Kollajen taze Sabitlenmemiş akciğerlerde fibrozis 10 ikna etmek için daha önce PBS (Şekil 2C) ile tedavi edilen farelerden alınan hasat veya bleomisin (Şekil 2B) ile tedavi için Şekil 2 CD gösterisi immunofluorescent boyama . Şekil 3A AFM microindentation elde edilen numune kuvvet-deplasman grafikleri gösterir. Aynı uygulanan kuvvet ile, AFM ucu (daha sert bir bölge için küçük bir girinti ve &quot;dik&quot; bir kuvvet-deplasman eğrisi karşısında görece &quot;düz&quot; bir kuvvet-deplasman eğrisi, yumuşak bir bölge (mavi çizgi) üzerinde geniş bir girinti oluşturur kırmızı çizgi). Temiz gücü eğrileri elde etmek amacıyla, her bir girinti sonra AFM ucu sonraki girinti önce numune yüzeyinden ve iletişim tamamen retrakte olması gerekir. Bu kişi devlet ucu konsol saptırmadan çevirir Şekil 3A, eğrinin düz bir bölgeye karşılık gelir. Şekil 3B ucu tamamen numune yüzeyinden retrakte değil ne zaman oluşur (örneğin yumuşak bir örnek, bir düz bir bölge olmadan tipik bir yanlış eğrisiucu) temas noktası belirlemek imkansız ttaches. Ucu tamamen yumuşak örnek kaldıysa, eğri, açık bir saptırma, ancak küçük bir gürültü olmadan, Şekil 3C gösterildiği gibi görünebilir. Şekil 4 sertlik haritaları (elastographs), kayma modülü ile renk skalaları gibi mekansal görüntülenir kuvvet-deplasman eğrileri çıkarılan kayma modülü verileri gösterir. Elastographs özellikle fibrotik akciğer örneği içinde çarpıcı farklılıklar normal aralığı ve doku kayma modülü dağıtımı (Şekil 4A) ve fibrozis (Şekil 4B) akciğer parankiminin ve kayma modülü büyük mekansal varyasyonlar göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 (A) bir fare akciğer parankim şerit üzerinden AFM prob gösteren faz kontrast mikrografı. Ölçeği bar, 50 mm. (B) normal fare akciğer dokusunun normal akciğer parankimi alveoler mikromimarisini laminin immün gösteriyor. Beyaz kutu, tipik olarak 80-80μm elastikiyet haritalama alanı gösterir. Ölçek çubuğu: 20 mm. (C ve D) immün serum fizyolojik (C) ve (D) bleomisin tedavi fare akciğer parankim kollajen. Ölçek barlar, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 (A) Temsilcisi yorumlanabilir kuvvet-deplasman eğrileri sırasıyla salin (mavi) ve bleomisin ile tedavi edilen (kırmızı) fare akciğer parankimi toplanır. Siyah çizgiler kaynaklanan küresel Hertz modeli en uygun ve bunlara karşılık gelen hesaplanan Young modülü ile etiketlenir. (B, C) Temsilcisi un-yorumlanabilir kuvvet-deplasman eğrileri. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 tuzlu su (A) ve bleomisin ile tedavi edilen (B) fare akciğer parankimi toplanan Temsilcisi elastographs. Renk çubukları kilopascals kayma modülü göstermektedir. Eksen etiketleri mikrometre mekansal ölçekte göstermektedir. Ölçek çubuğu: 20 mikron

<ol>
	<li>Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+flexibility+regulates+growth+and+apoptosis+of+normal+but+not+transformed+cells.">Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-C1350 (2000).</li><li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening.">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+and+smooth+muscle+Ca(2+)+signaling+in+lung+slices+from+different+mouse+strains.">Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains.</a> J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).</li><li>Thundat, T., Warmack, R. J., Chen, G. Y., Allison, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+and+ambient-induced+deflections+of+scanning+force+microscope+cantilevers.">Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers.</a> Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).</li><li>Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Kas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+probe-based+frequency-dependent+microrheology+of+polymer+gels+and+biological+cells.">Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells.</a> Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).</li><li>Butler, J. P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., Takishima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poissons'+ratio+of+lung+parenchyma+and+parenchymal+interaction+with+bronchi.">Poissons' ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi.</a> Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).</li><li>Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+amplification+of+fibrosis+through+matrix+stiffening+and+COX-2+suppression.">Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression.</a> J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).</li><li>Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., Ludwig, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+and+tissue+viscoelasticity+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis.+Temporal+aspects.">Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects.</a> Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).</li><li>Dolhnikoff, M., Mauad, T., Ludwig, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+oscillatory+mechanics+of+rat+lung+parenchyma+in+bleomycin-induced+fibrosis.">Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).</li><li>Rehfeldt, F., Engler, A. J., Eckhardt, A., Ahmed, F., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+responses+to+the+mechanochemical+microenvironment--implications+for+regenerative+medicine+and+drug+delivery.">Cell responses to the mechanochemical microenvironment--implications for regenerative medicine and drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).</li><li>Berry, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+injection+after+myocardial+infarction+improves+myocardial+compliance.">Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, 2196-2203 (2006).</li><li>Azeloglu, E. U., Bhattacharya, J., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+elastography+reveals+phenotypic+differences+in+alveolar+cell+stiffness.">Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness.</a> J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).</li><li>Wagh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+elasticity+measured+in+epithelial+cells+migrating+at+a+wound+edge+using+atomic+force+microscopy.">Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 54-60 (2008).</li><li>Martinez, F. J., Flaherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+function+testing+in+idiopathic+interstitial+pneumonias.">Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).</li><li>Cavalcante, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+collagen+and+proteoglycans:+implications+for+the+stability+of+lung+tissue.">Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue.</a> J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).</li><li>Hajji, M. A., Wilson, T. A., Lai-Fook, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+measurements+of+shear+modulus+and+pleural+membrane+tension+of+the+lung.">Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung.</a> J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).</li><li>Lai-Fook, S. J., Wilson, T. A., Hyatt, R. E., Rodarte, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+constants+of+inflated+lobes+of+dog+lungs.">Elastic constants of inflated lobes of dog lungs.</a> J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).</li><li>Azeloglu, E. U., Kaushik, G., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+hybrid+computational+model+of+AFM+indentation+for+analysis+of+mechanically+heterogeneous+samples.">Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4273-4276 (2009).</li><li>A-Hassan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy.">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

AFM microindentation ile akciğer dokusunun mekanik karakterizasyonu, doku sertliği microscale varyasyonları üzerinde benzersiz bir bakış açısı sağlayarak, benzeri görülmemiş uzaysal çözünürlük (Şekil 4). Kendi programını bir örnek olarak, normal ve fibrotik akciğer dokusunda şeritleri önceki makro ölçekli ölçümler fibrozis 11,12 ile elastance yaklaşık 2-3 kat artış gösterdi. Aksine, AFM microindentation ~ 30 kat artar, normal akciğer dokusu 10 gözlenen ortanca üzerinde kayma modülü sergileyen bazı bölgelerde doku sertleşmesi, çok lokalize olduğunu ortaya koymaktadır . Matris sertlik şimdi kritik hücre fonksiyonunu etkileyen Bilindiği gibi, bu yerel ölçümleri, akciğer hücrelerinin hücre kültürü çalışması biofidelity geliştirmek için paha biçilmez parametreleri sağlamak. Birkaç pratik konular, akciğer dokusunun ince şeritler kullanımı ile ortaya çıkar. Altta yatan alveoller mimari doku profili aşağıdaki gibi şeritler yüzeyler, tamamen düz değildir. Numune yüzeyinden yüksekliği değişimi bu zorluğu aşmalarına yardımcı olmak için 15 mm daha küçüktür AFM sistemi girinti sırasında otomatik olarak Z-yönünde ipucu konumunu ayarlar. Ölçümler oda sıcaklığında değil, 37 ° C yapılır, bu yüzden onlar küçük olması bekleniyor buna rağmen bu sıcaklık değişimi neden mekanik özelliklerinde sapmalar, değerlendirilemez. Gözlenen mekanik özellikleri altta yatan alveoler duvar mimarisinin etkisi mevcut ışık mikroskobu kurulumu ile belirlemek zordur. Örneğin, alveol duvarları ile uyumlu veya duvar düzlemine enine yönde girintili anizotropi ve farklı mekanik özellikler sergiler belirlemek için arzu edilmektedir. Ancak, mevcut örneklerinin kalın ve görüntüleme sistemi dolayısıyla temas her noktada yerel alveoler duvar yönünü belirlemek için mümkün değildir, 3 boyutlu yeteneklere sahip değildir. Son olarak, ölçülen mekanik özellikleri hücresel bileşenlerinin etkisi tam olarak aydınlatılamamıştır kalır. Burada ayrıntılı yöntemleri, hiçbir çaba özellikle doku hücresel bileşenleri kaldırmak için yapılır. Ancak, hücrelerin yüzeyinde girinti için kullanılabilir mevcut doku hasat ve alveoller erişmek için doku kesme zorunluluğu bu yana geçen süre göz önüne alındığında uygulanabilir olması muhtemel. Hücreleri çıkarmak ya da matrisler canlı hücreleri ile yeniden doldurmanız ve doku sertliği ortaya çıkan değişiklikleri değerlendirmek Belirli deneyler garanti görünecektir. Bu ölçümler için gerekli taze Sabitlenmemiş doku olduğundan, doku hasat ölçümü geçen süreyi en aza indirilebilir ve örnekleri, 4 ° C mekanik özelliklerinde değişiklikleri önlemek için saklanmalıdır. Doku şeritler yıkama veya minimum bozulma veya hasar oluşturulur ve böylece boyama sırasında konteynerler arasında transfer olduğu özellikle dikkat edilmelidir. Sıvı AFM uygulama için önemli bir adım, mümkün olduğunca düz doku kesim ve destekleyici lamel örnek hareketsiz. Varsa, bir vibratome ya da doku dilimleme makinesi gibi otomatik bir kesit makine son derece uniform kalınlıkta dilimlemek için kullanılabilir. AFM ölçümleri hemen önce, doku şeritler eklemek ve örnek sonunda lamelleri ayırmak olarak AFM ölçümleri için geçen süreyi en aza indirmek için önemlidir. Yararlı bir gözlem fişleri kapak ve küçük şeritler PBS içinde daha uzun süreler için yerinde kalması daha stabil bağlamak için büyük şeritler görünür. AFM microindentation 5 mikron çapında küresel ucu ile bir standart 0,06 N / m konsol kullanarak 100 Pa 50 kPa (kayma modülü) için geniş bir aralığı kapsayan örnekleri karakterize. AFM, 0,6 ila 12 mm, 0,01 ila 0,58 N / m arasında değişen çap ve yay sabitleri piyasada bulunan (örneğin Novascan) ve genellikle 3 kullanılan arasında değişen küresel cam ipuçları probları; Bu aralık, farklı yay sabitleri problar kullanılarak açılabilir. 5 mikron küresel bir ucu, ucu ve doku arasındaki teorik temas alanı, 400-700 nm girinti (Şekil 1A) için 5-9 mikron 2. Küçük veya daha büyük ipuçları, uzaysal çözünürlüğü daha küçük veya daha büyük ölçeklerde sağlamak için kullanılabilir. Piramidal ipuçları da daha az temas alanları sağlamak ve böylece veri uydurma, bu uç geometrisi için daha karmaşık olmasına rağmen, haritalama, mekansal çözünürlükte artan AFM microindentation 13-16 kullanılır. Bu yöntem çeşitli sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Akciğer geleneksel mekanik basınç-hacim analizi 17 ya da tüm akciğerlerin yumruk girinti 19,20 kullanarak örneğin, non-invaziv karakterize olmuştur. Hava-sıvı int kaybı yoluyla akciğer mimarisinin önemli yollarından değiştirmek Burada açıklanan biri olarak invaziv yöntemlernormalde hava dolu akciğer ve solunum kaslarının gevşemesi üzerine akciğer kısmi enflasyon korur öncesi stres kaybı var erface. Bu sınırlamalar, akciğer dokusunda şeritler 18 yapılan tüm ölçümlerde sık görülür . Özellikle, bununla birlikte, medyan sertlik dinlenme hacimleri 19,20 sağlam akciğerlere yumruk-girinti dayalı tahminlerden önemli ölçüde farklılık göstermemektedir parankimi normal akciğer dokusunun (kayma modülü ~ 0.5kPa) ölçülür. Akciğer dokusunda artan deformasyonla birlikte non-lineer sertleşme sergilemek bilinen olsa da, sıkı bir moda bu özellik burada istihdam yöntemleri ile mikro ölçekli aşağı devam olmadığını test etmek mümkün değildir. Hertz, model, örnek homojenlik varsayar. Ancak, akciğer parankiminin dahil olmak üzere birçok biyolojik maddeler, mekansal ölçekler azalan giderek daha heterojen. Young modülü, yani deforme katmanı veya bileşen göre girinti derinliğine bağlı değişimi gibi eserler örnek heterojen neden olabilir. Xy-düzlemi heterojenite biyomateryal Dimitriadis EK ve ark tarafından önerilen mikro bağlı olarak uygun bir küresel uç boyutu dikkatle seçerek sınırlı olabilir. 8. Bu malzeme nedeniyle Hertz modeli hatası tahmin ya da düzeltmek için çok daha zordur z-yönünde heterojenite. Azeloglu ve ark. Son zamanlarda ayrık gömülü kapanımlar 21 ile heterojen substrat elastik özelliklerini karakterize etmek için melez bir hesaplama modeli önerdi. Onların yeni bir teknik Hertz analiz sınırlamaları tamamen ortadan kaldırıp heterojen malzemeler dahil özelliklerini hesaplamak için potansiyel bir gelir sağlar. Biyolojik materyaller genellikle zamana bağımlı viskoelastik davranışları görüntülemek Hertz model aynı zamanda, mutlak elastik davranış varsayar. Tam bir doku viskoelastik karakterizasyonu değişen kullanılan girinti hızları elde edilebilir. Önemlisi, normal ve fibrotik akciğer dokusunda önceki makro ölçekli mekanik test, akciğer dokusunun mekanik özellikleri zayıf frekans bağımlılığı ve tüm frekansları arasında normal ve fibrotik doku mekanik özellikleri arasındaki farklılıkların korunması gösteren 11 test . Bu bulgular, güçlü tek bir girinti hızı ile AFM kullanarak mekanik özellikleri ölçümü fibrozis eşlik doku mekanik özelliklerinde değişiklikler önemli bir yönünü yakalar öneririz. Bu çalışmada kullanılan akciğer dokusu için 0,4 Poisson oranı makroskopik ölçüm 9. Ne yazık ki, Poisson oranı ve mikro ölçekli hastalığı koşul altında herhangi bir değişiklik, literatürde mevcut değildir. E, E / (1-υ 2) veya (1-υ 2) / πE alternatifler (elastik sabiti k gösterilir) olarak 22 AFM microindentation hesaplanır ve Poisson oranı bilinmiyor olabilir. En biyomalzemeler için Poisson oranı yüksek su içeriği nedeniyle 0,4 - 0,5 aralığında. 1 / (1-υ 2) faktörü 0.3-0.5 aralığı içinde, Poisson oranı makul farklılıklar rapor modülü sadece mütevazı etkiler, sadece 1,10-1,33 değişir. Normal doku fibrotik doku akrabası için rapor artış kayma modülü, Poisson oranı farklılıklar ile ilişkili hataları gözlenen mekanik özellikleri değişiklikleri küçük ima, büyüklüğü birkaç kat. Kuvvet-deplasman veri analizi için kullanılabilir gerçek algoritma ve kod özel uygulama durumu ve kuvvet-deplasman eğrileri çeşitli topluluklar sonraki özellikleri tabidir. Daha sofistike bir analiz ilgi ise, bir iş Lin ve ark danışabilirler 23. Yazarlar, daha önce Hertz girinti veri modelleri uydurma otomatikleştirmek için çabalarını engellemiştir komplikasyonlar birçok üstesinden bir algoritma sinerjik stratejilerinin bir dizi derlenmiş. Birçok diğer alanlarda daha da geliştirilmesi ve kullanılması için bu yöntem kullanılabilir. Bir antikor etiketleme olmadan alveol duvarlarını görselleştirme ilgi durumlarda, elastin ve kolajen yeşil spektrum autofluorescent sinyal görüntülenebilmekte. Öte yandan, ince doku kesitlerinde, 3D görüntüleme teknikleri ya da her ikisi kullanılarak daha iyi görüntüleme, mekanik özellikleri altında yatan mimari dokusu ilişkilendirmek için yeteneklerini geliştirmek. Mevcut yöntemlerden, kollajen ve laminin gibi ekstraselüler matriks bileşenleri boyama ve görselleştirme izin verirken, daha fazla çaba gösterilmesi, belirli hücre popülasyonlarının belirlenmesi ve bu tür popülasyonlarının çevresinde mekanik mikroçevrelerde karakterize hücre yüzey belirteçleri boyama hedef olabilir. Alternatively, doku işaretleyicileri veya hücre spesifik proteinlerin aynı hedefi takip soyundan floresan etiketli ifade farelerden alınan hasat olabilir. Son olarak, burada bozulmasina astım bozulmasina hipertansiyon damarları ve solunum yolları, akciğer, diğer anatomik özellikleri karakterize uygun görünür ayrıntılı yöntem. Göre, daha fazla geliştirme için potansiyel gelişimi ve bugünkü durumu hakkında AFM microindentation doku sertliği akciğer hastalığın ilerlemesi eşlik değişiklikler hakkında değerli bilgiler verim hazır görünüyor ve herhangi bir mekansal ve zamansal değişiklikler karakterize değeri şüphesiz diğer yumuşak dokularda çeşitli sertlik.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> AFM ucu </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 mikron Borosilikat boncuk, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-Lizin lamelleri </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 mm yuvarlak No.1 cam </td></tr><tr><td> Agaroz, Düşük Jelleşme Sıcaklık </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-Kollajen (PAB) Rb antikor </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 keçi anti-tavşan antikoru </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan, anti-Laminin </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

Matrix sertliği 1-3 yapışık hücrelerin büyüme, farklılaşma ve fonksiyon kuvvetle etkiler. Makro ölçekte doku ve organlar, insan vücudu içinde sertlik büyüklüğü 4 çeşitli siparişler kapsar. Daha az sertlik dokular içinde mekansal değişir nasıl bilinir ve sertlik değişikliklerin kapsamı ve mekansal ölçekte doku remodeling sonucu hastalık süreçleri nelerdir. Daha iyi anlamak matris sertlik değişiklikler, sağlık ve hastalık hücresel fizyoloji nasıl katkıda için, yerleşik hücreleri ile ilgili bir mekansal ölçekte elde edilen doku sertliği ölçümleri ihtiyaç vardır. Bu, akciğer, son derece uyumlu ve elastik doku matriks remodeling, astım, amfizem, hipertansiyon ve fibrozis gibi hastalıkların önemli bir özelliği olduğu için özellikle doğrudur. Yerleşik hücreleri ile ilgili bir mekansal ölçekte akciğer parankiminin yerel mekanik ortamı karakterize etmek için, biz doğrudan yerel atomik kuvvet mikroskobu (AFM) microindentation kullanarak taze fare akciğer dokusunun elastik özellikleri ölçmek için yöntemler geliştirdiler. AFM indentor, konsol ve girinti derinliği uygun seçeneği ile, bu yöntemler faz kontrast ve floresan görüntüleme ilgi bölge ile paralel olarak yerel doku kayma modülü ölçümleri izin verir. Doku şeritleri Sistematik örnekleme, kayma modülü yerel mekansal değişimler ortaya doku mekanik özelliklerini haritalar sağlar. Mekanik özellikleri ve altta yatan anatomik ve patolojik özellikler arasındaki korelasyon sertlik fibrozis matriks birikimi ile nasıl değişeceğini göstermektedir. Bu yöntemler yerel doku mekanik özelliklerini alan ve hastalığın ilerlemesi üzerinde nasıl değişiklik gösterdiğini ortaya çıkarmak için diğer yumuşak dokular ve hastalık süreçleri kadar uzatılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Görüntüleme.  Harvard School of Public Health. Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Video: Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Biyoloji

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...