Nous remercions A. Tager et B. Shea pour leur collaboration continue, et de fournir le tissu pulmonaire utilisés à des fins de démonstration ici. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde HL-092961. Ce travail a été exécuté en partie au Centre de systèmes de taille nanométrique (SNC), un membre du Réseau National Nanotechnology Infrastructure, qui est soutenu par la National Science Foundation en récompense NSF ECS-0335765. SNC est une partie de la Faculté des arts et des sciences à l&#39;Université Harvard.

1. Préparation bande de tissu pulmonaire <ol><li> Le tissu pulmonaire est très compatible et difficile à couper en lanières pour la caractérisation de l&#39;AFM. Pour stabiliser la structure transitoire pour la coupe des poumons, gonfler les poumons de souris isolées par voie intratrachéale avec le poids corporel de 50 ml / kg de 2% peu de gel d&#39;agarose points (préparé dans du PBS) chauffé à 37 ° C. Nouez la trachée et les poumons gonflés refroidir le dans un bain de PBS à 4 ° C pendant 60 minutes. L&#39;agarose gel et se raidissent dans les espaces aériens pour doucement stabiliser la structure du poumon au cours de cet intervalle 5. Des concentrations plus élevées d&#39;agarose, soit 3-4%, peut être utilisé pour améliorer encore la stabilisation de tissu pour la coupe. </li><li> Coupez le tissu agarose stabilisé la souris poumon avec un rasoir ou une lame de bistouri en bandes de 5 x 5 mm de longueur et de largeur et 400 um d&#39;épaisseur, puis lavez les bandes dans un bain de PBS préchauffé à 37 ° C à l&#39;aide de 100 ml récipient en verre sur une paillasse plaque d&#39;agitation chauffé pendant 5 minutes pour enlever les résidus d&#39;agarose. Pour exclure grandes voies aériennes et les navires, couper des bandes de régions sous-pleurales éloignée de la tige principale bronches. Si les voies respiratoires et les gros vaisseaux sont à imager, couper des bandes de tissu pulmonaire plus proximal au tronc principal bronches. </li></ol> 2. Microindentation AFM et d&#39;imagerie par fluorescence <ol><li> Afin d&#39;isoler les zones d&#39;intérêt pour microindentation AFM, les tissus peuvent être visualisées par microscopie à contraste de phase, ou immunocolorés et visualisé par microscopie à fluorescence. Pour immunomarquage, de bloquer des bandes de tissu avec 5% de sérum provenant de la source de l&#39;anticorps désiré secondaire (dans du PBS) pendant 2 heures sans fixation ou de perméabilisation à la température ambiante. </li><li> Incuber la bande de tissu avec l&#39;anticorps primaire appropriés (p. ex lapin anti-collagène de type I pour visualiser collagène interstitiel (1:250 dilution), de lapin anti-laminine (1:250 dilution) pour visualiser la membrane basale) dans un puits d&#39;une plaque de 12 puits sur une bascule en agitant doucement pendant 1 heure, laver l&#39;échantillon 3 fois pendant 5 minutes chacun avec PBS, suivi par un anticorps secondaire approprié conjugué à marqueur fluorescent (par exemple, Alexa Fluor 546 chèvre anti-lapin anticorps secondaire (1:250 dilution)) pour une heure à température ambiante. </li><li> Laver abondamment bandes de tissus avec du PBS et de stocker dans du PBS à 4 ° C </li><li> Immédiatement avant la caractérisation AFM, fixez la bande de tissu à un poly-L-lysine 15 mm lamelle en soulevant la lamelle de dessous le tissu flottant, en veillant à la bande de tissu répartit uniformément sur la surface de la lamelle, si nécessaire, un sandwich la bande avec un chiffon propre secondes, non couchés lamelle et appliquer une légère pression pour aider à la fixation des tissus de la lamelle de poly-L-lysine. </li><li> Calibrer le système AFM suivant l&#39;instruction de la manufacture immédiatement avant chaque tour d&#39;expériences microindentation. Déterminer deux paramètres essentiels: 1) le ressort cantilever constante en utilisant la méthode des fluctuations thermiques dans l&#39;air 6, et 2) la sensibilité déflection du cantilever, qui est un paramètre utilisé à l&#39;échelle du signal de sortie photodiode à la distance réelle déflection du cantilever, Ad. Calibrer la sensibilité de déviation par l&#39;obtention d&#39;une norme courbe force-déplacement en PBS sur une lame de verre propre, puis calculer la pente de la courbe force-déplacement (Fig. 1b). Dans la mesure courbe force-déplacement, la pointe de l&#39;AFM est prolongé vers et rétractée de la surface de l&#39;échantillon à un seul endroit (sans tramage dans des directions XY), avec la déviation du cantilever, Ad, suivie en fonction du déplacement pointe, Az . </li></ol> Nous vous recommandons d&#39;utiliser un cantilever triangulaire de nitrure de silicium avec un 5-um de diamètre borosilicate pointe sphérique (NovaScan). En utilisant des sondes AFM avec une constante de rappel de 0,06 N / m, nous avons caractérisé mécaniquement les matériaux mous avec des modules de cisaillement s&#39;étend de 100 à 50 000 Pa. <ol start="6"><li> Essuyez la surface inférieure de la lamelle échantillon avec du papier de soie, l&#39;attacher à une lame de verre standard avec graisse à vide, monter la lame de verre sur la scène de l&#39;échantillon AFM, et couvrent les tissus avec 500 ul de PBS (température ambiante). </li><li> Régler le microscope pour oculaire visualisation d&#39;aligner la pointe AFM dans le centre du champ de vue en ajustant le stade de l&#39;échantillon de microscope. Choisissez un domaine d&#39;intérêt sur les tissus en se déplaçant au stade de l&#39;échantillon AFM, puis passer à la caméra CCD pour enregistrer l&#39;image visualisation contraste de phase et / ou des images de fluorescence des tissus, comme souhaité. </li><li> Effectuer le fonctionnement standard d&#39;engagement AFM en déplaçant la pointe AFM lentement vers le bas jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit en contact avec l&#39;échantillon. </li><li> Caractérisation précise microindentation AFM d&#39;échantillons mous nécessite des profondeurs petite empreinte d&#39;éviter de grandes souches locales qui invalident le modèle de Hertz utilisée pour le module de calcul élastique. Pour éviter de grandes déformations, effectuez l&#39;indentation dans le mode de déclenchement en définissant la déflexion maximale cantilever (point de déclenchement) à 500 nm. Cette limite de flèche limiteront lavigueur indentation maximale à moins de 30 nN (F ressort cantilever = déplacement constants *, ou F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> La vitesse d&#39;indentation doit être choisie pour être suffisamment lente pour explorer les propriétés viscoélastiques plutôt élastique de l&#39;échantillon douce 7. Une gamme de vitesse de 2-20 um par seconde est approprié pour les tissus pulmonaires. <ol start="10"><li> Pour une mesure unique d&#39;un domaine d&#39;intérêt, de déplacer la sonde AFM à l&#39;emplacement d&#39;intérêt et d&#39;effectuer une mise en retrait de recueillir une norme Courbe force-déplacement (la sonde se déplace uniquement dans le sens Z, sans XY à balayage). </li><li> Pour la cartographie automatisée d&#39;une région d&#39;intérêt, passez à la Force-mode Carte, sélectionnez le format de numérisation et de points d&#39;échantillonnage dans la zone sélectionnée. En Force-mode Carte, les rasters pointe AFM sur la surface de l&#39;échantillon entre les mouvements d&#39;indentation, et recueille chaque courbes force-déplacement à chaque point dans une grille échantillon défini. Points d&#39;échantillonnage Plus offrira une meilleure résolution spatiale, mais d&#39;allonger le temps requis pour la cartographie. Nous avons trouvé qu&#39;il pratique à utiliser une grille de 16 x 16 échantillons pour mapper un 80 x 80-um espace à une vitesse d&#39;indentation de 20 um par seconde, ce qui peut être complété en ~ 10 minutes. </li></ol> 3. AFM Extraction de données <ol><li> Pour calculer le module d&#39;Young, l&#39;ajustement de la courbe force-déplacement au modèle d&#39;indentation sphérique Hertz à l&#39;aide des moindres carrés non-linéaires raccord courbe 8 (Fig.1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> où F = k c * Δ d, est la force de plier le cantilever, k c est le ressort cantilever constante, R est rayon de la pointe sphère, δ = Δ z - Δ d est l&#39;indentation et υ est le ratio de l&#39;échantillon de Poisson (υ = 0,4 pour 9 tissu pulmonaire). </li><li> Pour évaluer la qualité de l&#39;ajustement, calculer la valeur SSR, ou la somme des carrés de la différence entre les données et les valeurs d&#39;ajustement, pendant le montage courbe non linéaire. Éliminer les mesures peu fiables ou non interprétables en éliminant des données de «mauvais» des courbes avec des valeurs SSR grande. </li><li> Si désiré, de convertir le module d&#39;élasticité (E) pour le module de cisaillement (G), en utilisant la relation E = 2 x (1 + υ) x G. Pour visualiser la répartition spatiale de la raideur recueillies dans Force-mode Carte, tracer les données dans le module contours des cartes (par exemple en 16 x grille de 16 échantillons couvrant une 80 x 80 um région). </li><li> Pour traiter une grande quantité de données courbe de force, un algorithme personnalisé peut être écrit pour ajuster automatiquement courbes force-déplacement, extrait de modules, et / ou elastographs parcelle en utilisant les mêmes procédures et les paramètres comme indiqué en 3.2 et 3.3 (par exemple Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figure 1" /> La figure 1 (A) Schéma d&#39;microindentation AFM d&#39;un échantillon douce sur un substrat rigide à l&#39;aide d&#39;une sonde sphérique (Reproduit avec la permission de Dimitriadis E., et al. Biophys 2002 J 8). (B) représentant la courbe force-déplacement recueillies auprès d&#39;un lame de verre propre dans du PBS pour déterminer la sensibilité déflection du cantilever. (C) représentant courbes force-déplacement recueillies auprès mous (bleu) et rigide (rouge) des échantillons montrant les paramètres correspondants de (A). 4. Les résultats représentatifs: La figure 2A montre une bande de parenchyme pulmonaire ci-joint sur le poly-L-lysine lamelle enduit PBS avec une sonde AFM en place directement au-dessus région d&#39;intérêt et de prêts pour la cartographie microindentation. Figure 2B montre que dans le tissu bien coupées et colorées, la microarchitecture du parenchyme pulmonaire alvéolaire est bien préservé, comme observé par immunofluorescence pour la laminine composante de la membrane basale sans fixation ou de perméabilisation. La figure 2 montre coloration CD immunofluorescence pour le collagène I dans les poumons frais non fixés récoltés à partir des souris préalablement traitées avec du PBS (figure 2C), ou traités avec la bléomycine (Fig. 2D) pour induire une fibrose 10. La figure 3A montre l&#39;échantillon force-déplacement obtenue à partir des parcelles microindentation AFM. Avec la même force appliquée, l&#39;AFM pointe génère une empreinte importante sur une région douce (ligne bleue), résultant en un temps relativement «plat» la courbe force-déplacement par rapport à une petite empreinte et un &quot;raides&quot; force-déplacement pour une courbe raide région ( ligne rouge). Afin d&#39;obtenir des courbes de force de nettoyer, après chaque retrait de la pointe de l&#39;AFM a besoin d&#39;être rentré complètement de la surface de l&#39;échantillon et libre de contact avant le retrait prochain. Cet état de contact libre correspond à la région plate de la courbe de la figure 3A, où la pointe se traduit, sans déflection du cantilever. La figure 3B montre une courbe typique de faux, sans une région plate qui se produit lorsque la pointe n&#39;est pas complètement rentré de la surface de l&#39;échantillon (par exemple, l&#39;échantillon douce unettaches à la pointe) qui rend impossible de déterminer le point de contact. Si la pointe est complètement pris au piège dans l&#39;échantillon doux, la courbe peut regarder comme le montre la figure 3C, sans fléchissement évident, mais petit bruit. La figure 4 montre les données de cisaillement module extrait de courbes force-déplacement dans l&#39;espace affiché sous forme de cartes de rigidité (elastographs), où les échelles de couleurs avec module de cisaillement. Elastographs démontrent des différences frappantes dans la gamme et la distribution du module de cisaillement des tissus dans des conditions normales (figure 4A) et fibrotique (figure 4B) du parenchyme pulmonaire, et de grandes variations spatiales de module de cisaillement, en particulier au sein de l&#39;échantillon pulmonaires fibreuses. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2 (A). Micrographie par contraste de phase montrant une sonde AFM sur une bande de souris parenchyme pulmonaire. La barre d&#39;échelle, 50 um. (B) immunocoloration de la laminine dans le tissu pulmonaire normal de souris montrant la microarchitecture du parenchyme pulmonaire alvéolaire normale. Boîte blanche indique typiquement 80 par 80μm zone cartographie élasticité. Barre d&#39;échelle: 20 um. (C et D) du collagène I Immunocoloration dans une solution saline (C) et la bléomycine (D) poumons de souris traitées parenchyme. Barres d&#39;échelle, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figure 3" /> La figure 3 (A). Représentant interprétables courbes force-déplacement recueillies auprès de solution saline (bleu) et la bléomycine-traitée (en rouge) de souris parenchyme pulmonaire, respectivement. Les lignes noires sont le meilleur ajustement résultant du modèle sphérique et Hertz sont étiquetés avec leurs correspondantes calculées modules d&#39;Young. (B, C) représentant de l&#39;ONU-interprétables courbes force-déplacement. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Elastographs Représentant recueillies auprès de solution saline (A) et la bléomycine-traitée (B) la souris parenchyme pulmonaire. Les barres de couleur indiquent module de cisaillement en kilopascals. Les étiquettes des axes indiquent échelle spatiale en micromètres. Barre d&#39;échelle: 20 um

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Caractérisation mécanique du tissu pulmonaire à l&#39;aide microindentation AFM offre une résolution spatiale sans précédent (fig. 4), offrant une perspective unique sur les variations de la rigidité du tissu micro. Comme exemple de son utilité, antérieure à macro-échelle des mesures dans des conditions normales et fibrotiques bandes tissu pulmonaire indique une approximative 2-3-fois plus élastance de fibrose 11,12. En revanche, microindentation AFM révèle que la rigidification des tissus est très localisée, avec certaines régions présentant jusqu&#39;à ~ augmente de 30 fois dans le module de cisaillement au-dessus de la médiane observée dans le tissu pulmonaire normale 10. Comme matrice de rigidité est maintenant connue pour influencer la fonction critique de cellules, ces mesures locales de fournir des paramètres précieux pour améliorer la biofidélité de l&#39;étude de culture cellulaire de cellules du poumon. Plusieurs questions pratiques se posent avec l&#39;utilisation de fines lanières de tissu pulmonaire. Les surfaces des bandes ne sont pas parfaitement plat, comme le profil des tissus suit l&#39;architecture des alvéoles sous-jacentes. Le système ajuste automatiquement la position AFM pointe dans la direction Z lors de l&#39;indentation lorsque la variation de hauteur de l&#39;échantillon de surface est inférieure à 15 um-pour aider à surmonter ce défi. Les mesures sont réalisées à température ambiante, et non pas 37 ° C, donc les écarts dans les propriétés mécaniques causés par cette variation de température ne peut pas être évaluée, bien qu&#39;ils seraient devrait être mineur. L&#39;influence de l&#39;architecture sous-jacente sur paroi alvéolaire observée propriétés mécaniques est difficile de déterminer avec la configuration actuelle microscopie optique. Par exemple, il serait souhaitable de déterminer si les parois alvéolaires présentent une anisotropie des propriétés mécaniques différentes et où en retrait dans des directions alignées ou transversale au plan du mur. Toutefois, les spécimens actuels sont épais et le système d&#39;imagerie n&#39;a pas les capacités 3D, il n&#39;est donc pas possible de déterminer l&#39;orientation du mur locales alvéolaires à chaque point de contact. Enfin, l&#39;influence des constituants cellulaires sur les propriétés mécaniques mesurées reste à élucider. Dans les méthodes décrites ici, aucun effort n&#39;est fait pour éliminer spécifiquement les constituants cellulaires des tissus. Cependant, les cellules présentes à la surface disponible pour l&#39;indentation sont peu susceptibles d&#39;être viable compte tenu du temps écoulé depuis la récolte des tissus et la nécessité de couper le tissu pour avoir accès à des alvéoles. Des expériences spécifiques pour enlever les cellules, ou repeupler les matrices de cellules viables, et d&#39;évaluer les changements résultant de la rigidité des tissus semble justifiée. Parce frais tissu non fixé est nécessaire pour ces mesures, le temps écoulé depuis la récolte des tissus à la mesure doit être minimisé et les échantillons doivent être conservés à 4 ° C pour éviter les changements de propriétés mécaniques. Une attention particulière devrait être accordée lorsque des bandes de tissu sont transférés entre les conteneurs pendant le lavage ou la coloration de sorte que la distorsion minimale ou le dommage est généré. Pour l&#39;application AFM en liquide, une étape cruciale consiste à couper le tissu le plus plat possible et d&#39;immobiliser l&#39;échantillon sur la lamelle de soutien. S&#39;il est disponible, une machine automatisée de sectionnement comme un vibratome ou trancheuse tissus peuvent être utilisés pour couper des tranches d&#39;épaisseur très uniforme. Il est important d&#39;attacher les bandes de tissu juste avant les mesures AFM et de minimiser le temps écoulé pour les mesures AFM que l&#39;échantillon sera éventuellement détacher les lamelles. Une observation utile est que les grandes bandes semblent attacher plus stable pour couvrir les glissades et rester en place pendant des durées plus longues dans le PBS que les petites bandes. Microindentation AFM peut caractériser les échantillons couvrant une large gamme de 100 Pa à 50 kPa (module de cisaillement) en utilisant un standard de 0,06 N / m en porte à faux avec une pointe de 5 pm de diamètre sphérique. Cette gamme peut être étendue en utilisant des sondes avec des constantes de ressort différentes; sondes AFM avec des conseils en verre sphérique allant de 0,6 à 12 um de diamètre et constantes du printemps allant de 0,01 à 0,58 N / m sont disponibles commercialement (par exemple NovaScan) et couramment utilisé 3. Avec une pointe de 5 um sphérique, la surface de contact théorique entre la pointe et de tissus est environ 5-9 um 2 pour 400-700 nm indentation (figure 1A). Conseils plus ou moins grande peut être utilisée pour fournir des échelles plus petites ou plus grandes de la résolution spatiale. Conseils pyramidal ont également été utilisés dans microindentation AFM 13-16, offrant des zones de contact plus petite et donc d&#39;augmenter la résolution spatiale de la cartographie, mais pose des données est plus complexe pour ce géométrie de la pointe. Plusieurs limites de cette méthode doit être noté. Le poumon a traditionnellement été caractérisé mécanique non invasive, par exemple en utilisant l&#39;analyse pression-volume 17 ou punch-indentation des poumons entière 19,20. Les méthodes invasives telles que celle décrite ici de modifier l&#39;architecture du poumon chez les façons importantes par la perte de l&#39;int air-liquideerface qui existe normalement dans les poumons remplis d&#39;air et la perte de pré-contrainte qui maintient l&#39;inflation pulmonaire partielle à la relaxation des muscles respiratoires. Ces limitations sont communes à toutes les mesures effectuées dans les bandes du tissu pulmonaire 18. Notamment, cependant, la rigidité médiane mesurée dans le parenchyme du tissu pulmonaire normal (module de cisaillement ~ 0.5kPa) ne diffère pas sensiblement de ces estimations basées sur le poinçon-indentation des poumons intacts à des volumes de repos 19,20. Alors que le tissu pulmonaire est connu pour présenter non linéaire raidissement avec une déformation croissante, il n&#39;est pas possible de tester de façon rigoureuse si cette propriété persiste jusqu&#39;à l&#39;échelle micro-avec les méthodes employées ici. Le modèle de Hertz suppose l&#39;homogénéité de l&#39;échantillon. Cependant, la plupart des matériaux biologiques, y compris du parenchyme pulmonaire, sont plus hétérogènes à diminuer les échelles spatiales. Hétérogénéité de l&#39;échantillon peut entraîner des artefacts comme la variation du module d&#39;Young en fonction de la profondeur d&#39;indentation, c&#39;est à dire en fonction de la couche ou un composant qui se déforme. L&#39;hétérogénéité dans le plan xy peut être limitée en choisissant soigneusement la taille appropriée pointe sphérique en fonction de la microstructure du biomatériau tel que proposé par Dimitriadis EK et al. 8 Il est beaucoup plus difficile à prévoir ou à corriger les erreurs du modèle de Hertz grâce au matériau hétérogénéité dans la direction z. Azeloglu et al. a récemment proposé un modèle hybride de calcul afin de caractériser les propriétés élastiques du substrat hétérogène, avec des inclusions discrètes intégrées 21. Leur nouvelle technique offre un potentiel moyen de calculer les propriétés d&#39;inclusion de matériaux hétérogènes surmonter les limites de l&#39;analyse hertziennes. Le modèle de Hertz suppose aussi absolue comportement élastique, tandis que les matériaux biologiques affichent généralement des comportements viscoélastiques dépendant du temps. Une caractérisation complète viscoélastiques du tissu peut être obtenu en faisant varier les vitesses d&#39;indentation utilisé. Surtout, antérieure à macro-échelle essais mécaniques du tissu pulmonaire normal et fibrotique démontre la dépendance de fréquence faible des propriétés mécaniques du tissu pulmonaire, et la préservation des différences entre les propriétés des tissus normaux et fibrotiques mécaniques sur toutes les fréquences testées 11. Ces résultats suggèrent fortement que la mesure des propriétés mécaniques en utilisant une vitesse d&#39;indentation simple avec l&#39;AFM capte un aspect essentiel de l&#39;évolution des propriétés mécaniques des tissus qui accompagnent la fibrose. Le coefficient de Poisson de 0,4 pour les tissus pulmonaires utilisés dans ce travail est d&#39;une mesure macroscopique 9. Malheureusement, le coefficient de Poisson au micro-échelle et des changements dans la condition la maladie ne sont pas disponibles dans la littérature. Comme alternatives à E, E / (1-υ 2) ou (1-υ 2) / πE (notée k constante élastique) 22 peut être calculée à partir de microindentation AFM et signalé lorsque le coefficient de Poisson est inconnue. Pour la plupart des biomatériaux coefficient de Poisson est dans la gamme de 0,4 à 0,5 en raison de leur forte teneur en eau. Dans la gamme de 0,3 à 0,5, le facteur 1 / (1-υ 2) ne varie que de 1,10 à 1,33, tels que les variations raisonnables dans le coefficient de Poisson d&#39;exercer que des effets modestes sur le module rapporté. L&#39;augmentation du module de cisaillement que nous rapportons à un parent tissu fibreux au tissu normal est de plusieurs fois l&#39;ampleur, ce qui implique que les erreurs associées à des variations dans le coefficient de Poisson sont mineures par rapport à l&#39;évolution des propriétés mécaniques observées. L&#39;algorithme réelle et le code qui peut être utilisé pour l&#39;analyse de la force-déplacement des données est soumise à la condition d&#39;application spécifique et des caractéristiques suivantes des diverses populations des courbes force-déplacement. Si une analyse plus sophistiquée est d&#39;un intérêt, on peut consulter les travaux de Lin et coll. 23. Les auteurs ont compilé une série de stratégies synergiques dans un algorithme qui permet de surmonter bon nombre des complications qui ont déjà entravé les efforts déployés pour automatiser le montage de modèles de données Hertz indentation. Plusieurs autres secteurs sont disponibles pour le développement ultérieur et l&#39;exploitation de cette méthode. Dans les cas où l&#39;on s&#39;intéresse à la visualisation des parois alvéolaires, sans marquage de l&#39;anticorps, à la fois élastine et de collagène peut être visualisé à partir de leur signal d&#39;autofluorescence dans le spectre vert. D&#39;autre part, une meilleure image, en utilisant soit des coupes de tissus plus fins, les techniques d&#39;imagerie 3D, ou les deux, pourrait améliorer la capacité à corréler avec les sous-tendent l&#39;architecture du tissu des propriétés mécaniques. Bien que les méthodes actuelles permettent la coloration et la visualisation des composants de la matrice extracellulaire comme le collagène et la laminine, des efforts supplémentaires pourraient être destinées à coloration marqueurs de surface cellulaire pour identifier les populations spécifiques de cellules et de caractériser les micro-environnements mécaniques dans le voisinage de ces populations. Alternatively, tissus pourraient être récoltés à partir des souris exprimant marqués par fluorescence lignée cellulaire des marqueurs ou des protéines spécifiques de poursuivre le même objectif. Enfin, la méthode détaillée apparaît ici bien adaptée à la caractérisation d&#39;autres caractéristiques anatomiques dans les poumons, comme les navires qui remodelage dans l&#39;hypertension, et les voies respiratoires, qui remodelage dans l&#39;asthme. Basé sur son état de développement actuel et le potentiel d&#39;améliorer encore, microindentation AFM semble prête à donner des aperçus précieux sur les changements dans la rigidité des tissus qui accompagnent la progression de la maladie dans le poumon, et sera sans aucun doute de la valeur pour caractériser les changements spatiaux et temporels dans la la rigidité d&#39;une variété d&#39;autres tissus mous.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> AFM pointe </td><td> NovaScan </td><td> PT.GS </td><td> 5 microns borosilicaté billes, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysine lamelles </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 mm de diamètre en verre n ° 1 </td></tr><tr><td> Agarose, basse température de gélification </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-collagène I (Rb pAb) antibody </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 chèvres anticorps anti-lapin </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-laminine </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

Matrice de rigidité influence fortement la croissance, la différenciation et la fonction des cellules adhérentes 1-3. A l&#39;échelle macro de la rigidité des tissus et des organes dans le corps humain durée de plusieurs ordres de magnitude 4. On connaît beaucoup moins sur la façon dont la raideur varie spatialement dans les tissus, et ce que la portée et l&#39;échelle spatiale des variations de rigidité sont dans les processus de la maladie qui en résultent dans le remodelage tissulaire. Afin de mieux comprendre comment les changements dans matrice de rigidité de contribuer à la physiologie cellulaire de la santé et la maladie, les mesures de la rigidité des tissus obtenus à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes sont nécessaires. Cela est particulièrement vrai pour le poumon, un tissu très compatible et élastique dans laquelle remodelage de la matrice est une caractéristique importante de maladies comme l&#39;asthme, l&#39;emphysème, l&#39;hypertension et fibrose. Pour caractériser l&#39;environnement local mécanique du parenchyme pulmonaire à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes, nous avons développé des méthodes pour mesurer directement les propriétés élastiques locales du tissu pulmonaire murin frais en utilisant la microscopie à force atomique (AFM) microindentation. Avec un choix approprié de l&#39;AFM pénétrateur, cantilever, et la profondeur d&#39;indentation, ces méthodes permettent de mesurer des locaux module de cisaillement des tissus en parallèle avec contraste de phase et d&#39;imagerie de fluorescence de la région d&#39;intérêt. L&#39;échantillonnage systématique des bandes de tissus fournit des cartes des propriétés mécaniques des tissus locaux qui révèlent des variations spatiales dans le module de cisaillement. Les corrélations entre les propriétés mécaniques et sous-jacentes des caractéristiques anatomiques et pathologiques illustrent la façon dont la raideur varie avec dépôt de matrice de la fibrose. Ces méthodes peuvent être étendues à d&#39;autres tissus mous et des processus de la maladie de révéler comment les propriétés mécaniques des tissus locaux varient à travers l&#39;espace et de progression de la maladie.

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Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

La rigidité de la matrice extracellulaire influence fortement les comportements multiples de cellules adhérentes. Matrice de rigidité varie spatialement à travers un tissu, et subit des modifications dans les diverses maladies. Ici, nous développons des méthodes pour caractériser les variations spatiales de la rigidité dans le tissu pulmonaire normal de la souris et fibrotiques utilisant la microscopie à force atomique microindentation.

Micro-Mécanique de caractérisation du tissu pulmonaire par microscopie à force atomique

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

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Biology

22.8K vues.  Harvard School of Public Health. La rigidité de la matrice extracellulaire influence fortement les comportements multiples de cellules adhérentes. Matrice de rigidité varie spatialement à travers un tissu, et subit des modifications dans les diverses maladies. Ici, nous développons des méthodes pour caractériser les variations spatiales de la rigidité dans le tissu pulmonaire normal de la souris et fibrotiques utilisant la microscopie à force atomique microindentation.

Vidéo: Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Recherche

Biologie

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

Caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell behavior such as cell function, differentiation, and motility. However, as these processes are not homogeneous throughout the whole organ, it has become increasingly important to understand changes in the mechanical properties of tissues on the cellular level.
To be able to monitor the stiffening of collagen-rich areas within the liver lobes, this paper presents a protocol for measuring liver tissue elastic moduli with high spatial precision by atomic force microscopy (AFM). AFM is a sensitive method with the potential to characterize local mechanical properties, calculated as Young&#39;s (also referred to as elastic) modulus. AFM coupled with polarization microscopy can be used to specifically locate the areas of fibrosis development based on the birefringence of collagen fibers in tissues. Using the presented protocol, we characterized the stiffness of collagen-rich areas from fibrotic mouse livers and corresponding areas in the livers of control mice.
A prominent increase in the stiffness of collagen-positive areas was observed with fibrosis development. The presented protocol allows for a highly reproducible method of AFM measurement, due to the use of mildly fixed liver tissue, that can be used to further the understanding of disease-initiated changes in local tissue mechanical properties and their effect on the fate of neighboring cells.

We present a protocol to measure the elastic moduli of collagen-rich areas in normal and diseased liver using atomic force microscopy. The simultaneous use of polarization microscopy provides high spatial precision for localizing collagen-rich areas in the liver sections.

Mesure de la rigidité hépatique par microscopie à force atomique couplée à la microscopie à polarisation

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

Microscopie à force atomique en mode contact en tant que technique rapide d’observation morphologique et d’analyse des dommages cellulaires bactériens

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Mesure de la rigidité dans les capillaires rétiniens de souris et la matrice sous-endothéliale

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that diabetes-induced retinal capillary stiffening plays a crucial and previously unrecognized causal role in inflammation-mediated degeneration of retinal capillaries. The increase in retinal capillary stiffness results from the overexpression of lysyl oxidase, an enzyme that crosslinks and stiffens the subendothelial matrix. Since tackling DR at the early stage is expected to prevent or slow down DR progression and associated vision loss, subendothelial matrix, and capillary stiffness represent relevant and novel therapeutic targets for early DR management. Further, direct measurement of retinal capillary stiffness can serve as a crucial preclinical validation step for the development of new imaging techniques for non-invasive assessment of retinal capillary stiffness in animal and human subjects. With this view in mind, we here provide a detailed protocol for the isolation and stiffness measurement of mouse retinal capillaries and subendothelial matrix using atomic force microscopy.

Pleins feux sur l’auteur : Étude de la rigidité vasculaire et de l’inflammation dans la rétinopathie diabétique précoce

We recently identified retinal capillary stiffening as a new paradigm for retinal dysfunction associated with diabetes. This protocol elaborates the steps for isolation of mouse retinal capillaries and the subendothelial matrix from retinal endothelial cultures, followed by a description of the stiffness measurement technique using atomic force microscopy.