עבודה זו מומנה על ידי המכון למדעי המוח RIKEN (BSI), תוכנית האדם Frontier Science (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN תוכנית ג&#39;וניור עמית מחקר (JRA, העניק לח&quot;כ) RIKEN המכון למדעי המוח (BSI), תוכנית אנוש המדע Frontier (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN עמית ג&#39;וניור תוכנית המחקר (JRA, העניק לח&quot;כ) מימנה את העבודה הזאת.

1. הכנת פתרון נימי ו-DNA להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA פלסמיד עם הכנה, מקסי או בשיטה שוות ערך, ולעשות ריכוז סופי של 2-3 מיקרוגרם / μl. Aliquot 100 מיקרוגרם של ה-DNA, להוסיף 10μl מהיר של צבע ירוק (1% מניות) ו TE (10mm טריס הבסיס, 1mm פתרון EDTA, pH 8.0) ולהתאים נפח μl 100 על מנת להפוך את ריכוז ה-DNA הסופי לערבב זריקה כדי 1μg / μl. ריכוז ה-DNA פלסמיד יכול להיות שונה תלוי בגודל של הפלסמיד, כמו גם יעילות transfection שלה, אשר צריך להיבדק לגופו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הפתרון DNA במשך 5 דקות ב 14,000 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר לאסוף supernatant כדי להסיר שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כוס זכוכית נימי צינורות tubea נימי באמצעות חולץ micropipette. לצבוט את הקצה עם מלקחיים כדי להטות את בעל קוטר 20-30 מיקרומטר. מדד 800 מיקרומטר-1 מ&quot;מ מקצה לבדוק את קוטר חיצוני הוא פחות מ 60 מיקרומטר (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את נימי micromanipulator, ולמלא עם שמן מינרלי. כדי למלא את נימי עם פתרון ה-DNA, לצלול לתוך קצה הפתרון ולמצוץ את פתרון ה-DNA. </li></ol> 2. סטיק אלקטרודות פלטינה כאן השתמשנו פלטינה מקל אלקטרודות (Nepe גן, CUY611P2-1) כדי electroporate לאזור שטחיים של המוח, כמו קליפת המוח (איור 1F). 3. הכנת מיקרו אלקטרודות השתמש מיקרו אלקטרודות electroporated לחלקים העמוקים של המוח (כלומר, התלמוס וההיפותלמוס) (איור 2 ב-E). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה אחד של טונגסטן (עבור אלקטרודות שליליות) ופלטינה (עבור אלקטרודות חיוביות) על חוטי הוא מפותל מצופה זהב סיכות קבוע עם parafilm. הכנס את החוט גזע של מקלון צמר גפן לעטוף את שני הקצוות עם parafilm (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שווה לחדד את קצה החוט עם נייר זכוכית עד שהוא מגיע 20-30 מיקרומטר קוטר חיצוני 60 מיקרומטר מ 800 מיקרומטר-1 מ&quot;מ של קצה (איור 1C ו-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעיל דק של לק על חוט לבידוד. לאחר לק התייבש, להשתמש ספוגית צמר גפן ספוג אצטון כדי להסיר אותו מקצה (כ 200 מיקרומטר מקצה). הערה חשובה: כדי למנוע נזק הרחם של העכבר, את החלק בתוך 800 מיקרומטר-1 מ&quot;מ של קצה צריך להיות לא יותר מ 70 מיקרומטר קוטר (איור 1E). </li></ol> 4. הכנת הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בהריון (E9.5-E15.5). אנו מדגימים הרדמה עם התרופות כיתה pentobarbital נתרן (לוח השנייה; 50 מיקרוגרם לכל גרם משקל גוף, להזריק intraperitoneally ולחכות 5 דקות). חלופות נתרן pentobarbital כחומר הרדמה כוללות הזרקת קטמין / Xylazine הרדמה או גז (גז עדיף נהלים זמן קצר). הזריקה צריכה להיעשות תוך תשומת לב כדי למנוע איברים, אחרת זה יגרום נזק הרחם או להרוג בעלי חיים. כאשר ה-IP מוצלח נעשה, שיעור ההישרדות הוא יותר מ -95%. כמו כן, הניתוח יכול להתבצע בסביבה באוויר הפתוח. בטרם החל המבצע הבדיקה, על חוסר התגובה של החיה כדי צובט הבוהן שלהם כדי לאשר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את שיער מהבטן באמצעות סכין גילוח ו EtOH 50%. הכינו את העור לסירוגין סקראבס של בבטאדין ואלכוהול (70%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך בכל קו האמצע הבטן במספריים דק ולהוציא את כל הקרניים הרחם בזהירות על 37 מעלות צלזיוס מראש חימם פוספט בופר סליין (PBS), לחלח גזה כותנה, אשר ממוקם באזור הפצע. שמרו על לחות הרחם עם PBS כל הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק כבל סיב אופטי גמיש בין המדד לבין האצבעות באמצע ולמקם אותו תחת קרן הרחם. כבל נקי עם EtOH 70% לפני השימוש. לא מיקרוסקופ או זכוכית מגדלת נדרשת ראיה. מיקום הרחם בין כבל סיב אופטי אור אופטיים את האגודל, וסוחטים בעדינות לדחוף את העובר קרוב לקיר הרחם. </li></ol> 5. הזרקה של DNA electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העובר ממוקם, הכנס זכוכית נימי בזהירות לתוך החדר היעד להזריק 1 כ μl של פתרון ה-DNA (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור electroporation לחלק השטחי של brainIf באמצעות אלקטרודות פלטינה עם מקל electoporation, במקום אלקטרודות מחוץ לרחם וליישם הציע גל מרובע פעימות הנוכחי על פי הוראה של ייצור (טבלה I). אם electroporation usingFor לחלק עמוק יותר של המוח, electroporation nmicro, אלקטרודות סוג eedle משמשים. Iinsert אלקטרודה טונגסטן בסדר שלילי מוזרק לתוך ה-DNA החדר ואת אלקטרודת פלטינה לתוך הרחם היעד באזור מקום בין שתי אלקטרודות, ולאחר מכן להחיל הציע גל מרובע פעימות הנוכחי (טבלה I) (איור 2 ב). </li></ol> 6. הודעה electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את גב קרן הרחם ב &#39;מקורית שלהמיקום inal עם ולהוסיף 500 μL של 37 ° C טרום חימם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את השכבה הפנימית עם תפר כירורגית השכבה החיצונית הדוק עם קליפ autoclipauto 9 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי המקום על כרית חימום למשך 2 שעות, כדי לאפשר ההתאוששות מן ההרדמה. משככי כאבים כגון carprofen או עצירות יכולה להינתן על הכאב שלאחר הניתוח. </li></ol> 7. נציג התוצאות: כמה דוגמאות של electroporation קליפת המוח של pCAG-EYFP לבנות באמצעות אלקטרודות פלטינה מקל בנקודות זמן שונות מוצגות באיור איור 32. מוחות הם electroporated ב E13.5, E14.5 ו E15.5, וקצרו ביום הלידה (P) 6. AThe מכתים ntibody של RORc מגלה עמדתו של שכבת 4 ואת המיקום של תאים EYFP transfected מתגלים כתמים על ידי נוגדן ה-GFP, והתמונות הן סופר שהוטל (איור 3A ו-B). תאים בקליפת המוח תווית הם שכבה של תאים בקליפת המוח electroporated הוא בבירור שונה בכל ניסוי (איור 32), אשר טוען תלוי זמן electroporation קליפת המוח הופכת שכבת ספציפי GOF / LOF אפשרי. הכדאיות של עוברים והיעילות של transfection התא משתנה בהתאם לגיל העובר ואת המיקום של electroporation. דוגמאות מפורטות על טבלה מס &#39;1, לעומת זאת, התנאים צריכים להיות מותאמים לכל electroporation בהתאם הבמה חלק של המוח. Electroporation לתוך רקמות עמוק כגון התלמוס וההיפותלמוס עם פלטינה באמצעות אלקטרודות מקל לעתים קרובות לתת יעילות נמוכה (טבלה 1). בעיה זו ניתן לפתור באמצעות מיקרו אלקטרודות whichelectrodes, אשר תגיע לחלקים העמוקים של המוח. איור 3 4 מראה דוגמה electroporation pCAG-EYFP לתוך diencephalon המתפתח. פתרון ה-DNA פלסמיד מוזרק לתוך ה -3 החדר בבית E11.5 ואחריו מיקרו electroporation (איור 3C4C). האזור electroporated מוגבל בתלמוס שבה רוב הפרויקט אקסונים אל הקורטקס (איור 3B4B). הקרנת אקסון לשכבה 4 של קליפת ניתן דמיינו גם EYFP, אשר fillesfills את נוירון כולו. (איור 3A4A). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סכמטית Cartoon הוכחת את הצורה הנכונה של נימי. (א) צינור זכוכית נימי הוא משך באמצעות חולץ micropipette לעשות צורה מסוימת. טיפ כבוי צבט ידי מלקחיים כדי לעשות את זה 20-30 מיקרומטר. מדד 800 מיקרומטר-1mm מקצה (סוגר אדום) ולוודא כי קוטר חיצוני הוא פחות מ 60 מיקרומטר (סוגר ירוק). (ב) קצה אחד של טונגסטן או חוטי פלטינה הוא מפותל על מצופה זהב סיכות קבוע עם parafilm. ואז להשתמש בנייר חול לבצע קצה שלהם להפוך 2-30 קוטר חיצוני מיקרומטר ו 60 מיקרומטר 1 מ&quot;מ של קצה. (ג) תמונה של חוט טונגסטן לפני בעיצוב. (ד) תמונה של חוט טונגסטן לאחר עיצוב. (ה) תמונה של חוט טונגסטן לאחר החלת מעיל דק של לק. בר סולם ב E הוא 10 מיקרומטר (בקנה מידה קטן) עבור לספירה. (F) פלטינה Stick אלקטרודות (גן Nepa. CUY611P2-1). בר סולם בפה הוא 2 מ&quot;מ. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Cartoon סכימה של הליך כירורגי. (א) תרשים של הזרקה לתוך החדר לרוחב או עוברי גדול (צד שמאל) לתוך החדר ה -3 או עוברי קטן (צד ימין). (ב) תרשים של electrporation ידי אלקטרודה פלטינה מקל (צד שמאל) על ידי אלקטרודה מחט סוג (צד ימין). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. פיתוח עכבר telencephalon היה electroporated עם pCAG-EYFP E13.5 ב (א), E14.5 (B) E15.5 (C) שנקטפו ב P6. המוח נותחו העטרה ומוכתמת עם נוגדן GFP או נוגדן RORc בנפרד ותמונות ימוזגו. (א) electroporation של pCAG-EYFP פלסמיד ב E13.5 transfect 4 נוירונים רבים בשכבה. אשר חפיפה עם שכבת סמנים RORc 4. (ב) electroporation של pCAG-EYFP פלסמיד ב E14.5 תאים transfect, שהם שטחיים יותר שכבה 4 נוירונים. (ג) E15.5 תווית electroporation נוירונים שטחית רבים כגון שכבה 2 / 3. סולם בר 200 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. Transfection של EYFP לתוך thalamo-קליפת המוח אקסונים (TCA). (א) הסופית TCA בשכבה קורטיקליים 4 מתגלה על ידי מכתים נוגדן ה-GFP. מכתים RORc הנוגדן משמש כדי לחשוף את המיקום של שכבה 4. התמונות הן לקוחים סעיף זהה הממוזג. (ב) קבוצה של electroporation אל התלמוס מוצג גם על ידי צביעת נוגדן ה-GFP ו מכתים RORc, אשר הביטוי מוגבל של התלמוס 11. (ג) סכמטית Cartoon עבור electroporation thalamic והשלכה TCA מוצגים. סולם בר 200 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hes+genes+and+neurogenin+regulate+non-neural+versus+neural+fate+specification+in+the+dorsal+telencephalic+midline.">Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline.</a> Development. 135, 2531-2541 (2008).</li><li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP,+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex.">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development Growth &#38; Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li><li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+Embryology.">Avian Embryology.</a> Methods in Cell Biology. Vol 87, 271-271 (2008).</li><li>Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice.">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).</li><li>Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally-controlled+site-specific+mutagenesis+in+the+basal+layer+of+the+epidermis:+comparison+of+the+recombinase+activity+of+the+tamoxifen-inducible+Cre-ERT+and+Cre-ERT2+recombinases.">Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases.</a> Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).</li><li>Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterned+expression+of+orphan+nuclear+receptor+genes+ROR+alpha+and+ROR+beta+in+developing+mouse+forebrain.">Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain.</a> Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בפרוטוקול זה, אנחנו רק תיאר היתרונות של השיטה של ​​transfection pCAG-EYFP לאזור המוגבל של מוח העובר קטן באמצעות אלקטרודות בצורת שונות. לשם השוואה של יעילות transfection על ידי האמרגן שונה שתואר לעיל, אשר מציגה סוג תא סגוליות 1. עם זאת, ישנן מגבלות על הטכניקה, כגון transfection הוא חולף רק משתנה תלוי פלסמיד, אין לו שום ייחוד תא וקשה לשלוט במספרים של תאים transfected. ThereforeHowever, שילוב של פרוטוקול זה עם טכניקות אחרות יהיה עוד לספק אפשרויות שיטות מניפולציה שונות. ראשית, שילוב מקדם תאים ספציפיים לתוך פלסמיד דנ&quot;א יאפשר לתא מסוג transfection ספציפיים, כגון נוירונים ותאי גלייה ו האסטרוציטים. שנית, מאז transfection הוא חולף, זה לא מתאים מדענים שרוצים לנתח את הפונקציה של הגן בשלב מאוחר יותר בחיים. לכן, בשילוב עם transposase לעשות פלסמיד דנ&quot;א להשתלב בגנום יהיה להמיר אותו לתוך transfection יציב 8. האימוץ הבא של ט או ט את המערכת תאפשר לתפעל את העיתוי או סוג תא ספציפי ביטוי גנים בתאים עצביים 8. לחלופין, אפשר לשלב את זה עם פרוטוקול ועין מתנהלת-טמוקסיפן Cre-ER (T) recombinases 9 ועכברים הכתב 10. זו נגישות רחבה של רקמות יהיה דרסטי לשנות עיצובים ניסיוניים בשימוש במדעי המוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> טונגסטן חשוף חוט בקוטר 125 מיקרומטר </td><td> AM מערכות </td><td> 797600 </td></tr><tr><td> פלטינה חשוף חוט בקוטר 125 מיקרומטר </td><td> AM מערכות </td><td> 767000 </td></tr><tr><td> סטיק אלקטרודות </td><td> Nepa גן </td><td> CUY610P4-1 </td></tr><tr><td> צינור זכוכית נימי </td><td> Stoelting </td><td> 50611 </td></tr><tr><td> micromanipulator </td><td> KD מדעי </td><td> KDS310 </td></tr><tr><td> מספרים </td><td> ROBOZ </td><td> RS-5865 </td></tr><tr><td> הדופק גנרטור </td><td> AM מערכות </td><td> דגם 2100 </td></tr><tr><td> 9 מ&quot;מ autoclip </td><td> ROBOZ </td><td> RS-9260 </td></tr><tr><td> מצופה זהב סיכות </td><td> WPI </td><td> 5482 </td></tr><tr><td> RORc נוגדן </td><td> פרסאוס Proteomics </td><td> H3925 </td></tr></tbody></table>

mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection

על מנת להבין את תפקידם של גנים הביע באזור מסוים של המוח המתפתח, כולל מולקולות איתות והדרכה מולקולות האקסון, העברת גנים מקומיים או עקום החוצה נדרשת. ג&#39;ין מיקוד עקום או עקום החוצה לאזורים המקומי ניתן לבצע בשילוב עם קו Cre ספציפי, שהוא מייגע, יקר, זמן רב. לכן, שיטה transfection פשוט, טכניקה electroporation ברחם, אשר יכול להתבצע עם זמן קצר, יהיה בהישג יד כדי לבדוק את תפקוד אפשרי של גנים מועמדים לפני דור 1,2 חיות טרנסגניות. בנוסף לכך, ב electroporation ברחם מטרות אזורים במוח שבהם אין קו ספציפי Cre קיים, יגביל הקטלניות עובריים 3,4. כאן, אנו מציגים שיטה ב electroporation ברחם שילוב של שני סוגים שונים של אלקטרודות להעברת גנים קל ונוח לתחומי היעד של המוח המתפתח. ראשית, שיטת החזקה ייחודית של עוברים באמצעות סיב אופטי כבל אופטי אור יגרום עוברים קטנים (מ E9.5) גלוי להזרקה פתרון ממוקד דנ&quot;א לתוך החדרים וסוג אלקטרודות מחט הכניסה לאזור המוח ממוקד 5,6. דפוסים של המוח כגון אזור בקליפת המוח מתרחשת בשלב עוברי מוקדם, ולכן, אלה electroporation מוקדם E9.5 תרומה גדולה להבין את האירוע כולו דפוסים אזור. שנית, את הצורה המדויקת של נימי מונע נזק הרחם על ידי יצירת חורים על ידי הכניסה של נימי. יתר על כן, הצורה המדויקת של אלקטרודות מחט נוצרות עם טונגסטן חוט פלטינה חידד שימוש בנייר חול מבודד עם לק 7, שיטה אשר מתואר בפירוט רב בפרוטוקול זה. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד לאזורים מוגבלים של המוח יאפשר עוברי קטן להיות electroporated. זה יעזור, לפתוח חלון חדש של מדענים רבים שעובדים על התמיינות תאים, נדידת תאים, הדרכה האקסון עובריים בשלב מוקדם מאוד. יתרה מכך, טכניקה זו תאפשר למדענים transfect DNA פלסמיד לחלקים העמוקים של המוח המתפתח כגון התלמוס וההיפותלמוס, שם לא רבים ספציפיים באזור קווי Cre קיימים למטרות רווח של הפונקציה (GOF), או הפסד של (LOF) מנתח לתפקד.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection at JoVE.com

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

mouse-utero-electroporation-controlled-spatiotemporal-gene

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

42.7K Views.  RIKEN Brain Science Institute. העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

Video: Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...