אנו מודים לחץ הומנה רשות לפרסם פיפטה microinjection ייצור דמות אשר הופיע במקור בעמוד 130 התייחסות 11, לארי Dlugas וסטיבן וונג, OHSU החוג לתקשורת חינוך, על videography, לארי Dlugas לעיצוב וידיאו ועריכה: אדם מ O &quot;קווין, מעצב בכיר, Trion / Envirco לעיצוב מותאם אישית זרימת אופקי שלנו למינרית מכסה המנוע Les גולדסמית למתן סכמטי טכני; ויקטור Monterroso, MV, MS, PhD וטום Chatkupt, DVM, OHSU המחלקה לרפואה השוואתי, עם הדרכה שלנו בעלי חיים פרוטוקול טיפול, טכניקות כירורגיות, ו מניעתי כאבים משטר, מרסל Perret-ג&#39;נטיל, DVM, MS, לשיתוף דף מידע על טכניקות תפירת וטרינריים, אדוארד מפורסוב, MS, לעיצוב Adobe Premiere שלנו במיקרוסקופ Pro תחנת עבודה וידאו במחשב, ולאה הלבן ג&#39;ונאס הינקלי של LNS captioning (פורטלנד, או). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות otheR-להפרעות בתקשורת: DC ו DC R01 008595 008595 R01-04S2 (כדי JB) ו - p30 DC005983 (אורגון שמיעה מרכז המחקר Core גרנט, פיטר גילספי, החוקר הראשי).

1. הגחון laparotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים סכר אשר עוברים נמצאים היום העוברית 11.5 (E11.5: בצהרי היום תוסף הנרתיק הוא מזוהה היום 0.5 של ההתפתחות העוברית) בזריקה intraperitoneal של פתרון pentobarbital נתרן הרדמה (7.5 μL לכל גרם משקל גוף). עבודה ההרדמה: 180 μL של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​נתרן פתרון pentobarbital: 100 μL של אתנול מוחלט; 320 μL של 65 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מגנזיום סולפט מימית (מודולציה הטון הרחם), ו 400 μL של פרופילן גליקול (בליל רכב עם מימית ואורגנית רכיבים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את השלמות של הרדמה על ידי ביצוע בדיקות גירויים רעילים: לסחוט כפה, קמצוץ הזנב, והוא כהרף בתגובה למגע הלחי vibrissae. החל משחת עיניים סטרילית את קרניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הפרווה מאזור הבטן suprapubic אל כלוב הצלעות עם המזמרה ולהב בסדר (אוסטר # 40 להב). לחטא את הבטן עם אתנול 70%, יוד povidone 10% (בבטאדין),ND אתנול 70%, ברצף. במקום העכבר הבטן בצד על וילון סטרילית ולאחר מכן הגדר על כרית חימום או צלחת חמה (37 מעלות צלזיוס) במשך 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את העור בטן קו האמצע הגחון עם הכדור שקצהו מספריים. להרחיב את החתך של 10-14 מ&quot;מ. זהה את Linea alba, avascular, רקמת חיבור פס לבן לאורך קו האמצע הגחון של דופן הבטן. לחרות Linea alba עם הכדור היטה מספריים ולהרחיב מ&quot;מ 10-14 החתך. מיד להשקות את הבטן עם prewarmed (37 ° C) פתרון של לקטט רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחצינים את שתי קרני הרחם עם מלקחיים הטבעת בלי הפעלת לחץ מופרז על אתרי ההשתלה. להשקות את קרני הרחם מוחצנים עם פתרון, prewarmed לקטט רינגר. </li></ol> 2. Transuterine Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק עבה קירות, זכוכית בורוסיליקט נימי microinjection פיפטה עם המאפיינים הבאים: 12-16 μמ &#39;קוטר חיצוני ו שפוע 20 מעלות. על חולץ P-97 פיפטה סאטר עם נימה קופסה קטנה, השתמש בתוכנית הבאה: חום = מבחן כבש בתוספת 3 יחידות, לחץ = 200; למשוך = 0; מהירות = 46; זמן = 100). עם beveler סאטר BV-10, השתמש בדיסק 104C (זהב) שוחקים עבור בטפי להחדרת נוזלים בקוטר גדול. הביטוי Resuspend פלסמיד ב מיקרוגרם μL 3-4 / ב סידן פוספט חינם שנאגרו מלוחים (pH 7.2-7.4). הוסף ירוק מהיר גבישי מערבולת ריכוז ה-DNA, בעדינות למשך 30 שניות, מסתובבים גרם 10,000 למשך 10 שניות. כמות מינימום של ירוק מהיר נדרש חזותית לעקוב אחר היעילות של הזרקת נקבע באופן אמפירי. לגבות את פיפטה beveled עם ה-DNA / פתרון ירוק ומהירה. חבר את הצינורית microinjection טעון לבעל פיפטה של ​​לחץ ההזרקה (Picospritzer באמצעות&gt; חנקן טהור 99% כגז מקור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transilluminate הרחם בעוצמה נמוכה, אור הלוגן לדמיין את העובר בתוך אתר ההשתלה שלה. זהה את ביהטינג לב, שלפוחית ​​המוח, ניצנים הגפיים, החדר המתהווה 4 של ה למוח האחורי, והעין. להשקות את הרחם כל 2 דקות עם prewarmed, לקטט הפתרון של רינגר לשמור על הידרציה. להפעיל לחץ עדין על הרחם לארגון מחדש של העובר ולזהות את ציוני דרך אנטומיים שצוין לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט העובר לזהות את הווריד ראש העיקרית אשר הקדמי ואת האחורי האגף סניפים בשטח mesenchymal שבו otocyst מתגורר. Otocyst נכונה לא ניתן לראות על ידי שקוף של הרחם. Otocyst ממוקם באמצע הדרך בין הענפים הקדמי וגם האחורי של עורק הראש העיקרי שבו, יחד עם המטען הראשי של הווריד, יוצרים את הצורה של הזקפים או עמודי השער במגרש הכדורגל האמריקאי. Otocyst הוא באמצע הדרך בין הניצבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס פיפטה הזרקת דרך הרחם במסלול בקנה אחד עם מיקום משוער של otocyst. הדופק microinjector פעם אחת לאחר שעברו דרך uterלנו לדמיין את צבע נותב ואת המיקום המשוער של קצה פיפטה. לקדם את פיפטה בשליטת מיקרומטר והדופק שוב כדי להעריך לעומק. לקדם את פיפטה לתוך mesenchyme ראש הדופק לרוחב שוב ושוב. מיקוד otocyst מוצלח יגלה את הצורה של צינור קוני endolymphatic dorsally ו צדפות קרב הצורה של הכניסה. לשחרר את הלחץ על הרחם, הסר פיפטה מעובר / רחם בתנועה אחת, ומיד להשקות את הרחם עם prewarmed, לקטט בתמיסת רינגר. </li></ol> 3. ב electroporation vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקות את הרחם בתמיסת רינגר של לקטט. פתרון רינגר לקטט של יישומי טרי יש כמה חשמלית את המשוט בסגנון אלקטרודות אל הרחם. להרטיב את פני השטח של אלקטרודות טונגסטן עם לקטט רינגר של. מרכז otocyst מוזרק בדרך של האלקטרודות. בעדינות לדחוס את הרחם עם הרשות הפלסטינית electroporationddles. הקתודה היא במגע עם דופן הרחם לרוחב כדי otocyst הזריק האנודה נמצא בקשר עם דופן הרחם סמוך otocyst uninjected. לעורר גל מרובע הדופק הרכבת עם הבורר דוושת רגל על ​​electroporator. פרמטרים electroporation הם: 5, 50 msec פעימות ב 43 וולט בכל הדופק ואת עיכוב 950 msec interpulse. מיד להשקות את הרחם לאחר הרכבת הדופק מועבר. הרשומה הנוכחית נמסר רקמות: 60-100 mAmps די transfect אבות אפיתל otic. מזריקים ו electroporate 4-6, עוברים E11.5 לכל הסכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microinjection 2, transuterine עצמאית של מימית ניאון dextran (Alexa פלואוריד 488 אם הביטוי פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי אדום או אלכס פלואוריד 594 אם הביטוי פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק) אל החדר 4 ה של עוברים אלה שאוזניו הפנימי הם מוזרק בצורה מדויקת לפחות 60 mAmps של זרם לכל הדופק היה דהlivered במהלך electroporation. Dextran ניאון יהיה להבחין בלידה בשנים למוח האחורי ולאפשר מבחר גורים אשר האוזניים הפנימי שניצלו אותם במהלך embryogenesis (ראה 3.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקות את קרני הרחם עם לקטט רינגר של. הכנס מחדש את קרני הרחם לתוך חלל הבטן. לרוקן את חלל הרחם עם 2-4 מ&quot;ל של פתרון, prewarmed לקטט רינגר ולאפשר גלישה לניקוז מחוץ לאתר את החתך על וילון סטרילית. החלף כורכת חומר יבש סטרילית. לתפור את דופן הבטן עם מחט ללא חיתוך ו תפר 6-0 resorbable. אנחנו מעדיפים לתפור ריצה, נעילת כל בגד אחר, על הקיר הן לעור הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש פרווה של האימהות ולנהל שאינם סטרואידים נגד דלקת כגון Meloxicam בזריקה תת עורית. להחזיר את הסכר לכלוב התאוששות prewarmed על וילון סטרילית. לנטר ולהקליט הנשימה של סכרים, אתר patency החתך, והנרתיק להזרמת דם. הדימום הוא דלקת מפרקים שגרוניתמחדש, אבל אם ההווה ללא הפוגה, להרדים את הסכר בזמן שהיא עדיין תחת הרדמה. שים לב פעם שהיא חוזר להכרה ומנסה ambulate. להחזיר את הסכר למושבה העכבר כאשר היא מראה סימנים של אכילה ושתייה החלה לקנן לבנות. בדרך כלל, זה קורה תוך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הלידה (יום לאחר הלידה 0), קבע פלאש באזור למוח האחורי של כל גור באפריון לזהות dextran ניאון באמצעות מיקרוסקופ לנתח stereofluorescence עם GFP או טקסס האדום מסנן על פי הצורך. חזור אל הסכר מניקות רק את הגורים המוצגים תיוג למוח האחורי. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/3653/3653fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בתיווך electroporation גן העברה שבלול המתפתח. Otocyst E11.5 הזריקו חלבון פלסמיד ביטוי משופרת קידוד פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ו electroporated (הדופק traבכל הפרמטרים: 5, 43 וולט פולסים של 50 אלפיות השניה / 950 דופק איחור msec interpulse). א) האוזן הפנימית נציג מיום הלידה 6 (P6) גור, אשר הוזרק otocyst ו electroporated ב E11.5 הוכחת ביטוי EGFP מהבסיס דרך בתורו באמצע שבלול. קיר לרוחב של שבלול הוסר בתורו איפקס התיכון בלבד. אבות E11.5 שיוצרים איפקס לא transfected. ב) הר שלם immunostaining של שבלול ב (א) עם סמן את התא שיער, 7 א שרירן (Myo7a), עולה כי הביטוי EGFP בעקבות המסלול של האיבר של קורטי ו מותאמת גסה את האפיתל שיער תא נושאת חושית. ג) האוזן הפנימית נציג מעובר E18.5 אשר otocyst שהוזרק ו electroporated ב E11.5. הקרנת לייזר confocal מדגים ביטוי EGFP ב Myo7a חיובי תאים שיער חושיות. D) הקרנת לייזר confocal של האפיתל חושית שבלול מאיבר E18.5 של קורטי המציין EGFP expression בתאי השיער הפנימיים (IHC), בתאי השיער החיצוניים (OHC), תאים phalangial הפנימיים (IPC), תאים עמודים (PC), ותאים של Deiters (DC). בר לגודל (ב &#39;) חל על (א&#39;).

<ol>
	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear.">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).</li><li>Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+fate+in+the+sensory+epithelia+of+the+inner+ear.">Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).</li><li>Ohyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+necessary+for+patterning+the+sensory+and+nonsensory+regions+of+the+developing+mammalian+cochlea.">BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).</li><li>Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+the+generation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+mammalian+inner+ear.">Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).</li><li>Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+auditory+hair+cells+produced+in+the+mammalian+cochlea+by+in+utero+gene+transfer.">Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer.</a> Nature. 455, 537-541 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+theories:+a+review.">Membrane electroporation theories: a review.</a> Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li><li>Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-mediated+gene+transfer+to+the+developing+mouse+inner+ear.">Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear.</a> Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).</li><li>Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+mouse+inner+ear+and+origin+of+its+sensory+organs.">Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs.</a> J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).</li><li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse.">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).</li><li>Sheffield, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector+tropism+for+supporting+cells+in+the+developing+murine+cochlea.">Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea.</a> Hear Res. 277, 28-36 (2011).</li><li>Bedrosian, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+delivery+of+recombinant+viruses+to+the+fetal+murine+cochlea:+transduction+characteristics+and+long-term+effects+on+auditory+function.">In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function.</a> Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).</li><li>Reisinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+functional+equivalence+of+otoferlin+and+synaptotagmin+1+in+exocytosis.">Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis.</a> J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).</li><li>Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Gateway+to+MultiSite+Gateway+in+one+recombination+event.">From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event.</a> BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).</li><li>Perret-Gentil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Veterinary Suturing. , .</li><li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

העברת גנים לאוזן העכבר בפיתוח פנימי: האוזן הפנימית העכבר מתפתחת placode otic בשבוע הראשון של פיתוח postimplantation 12,13. ביום העוברית 9.5 (E9.5), placode יש invaginated ו morphed לתוך שלפוחית ​​מלא נוזלים הנקרא otocyst 2. מבשרי Otic ב שלפוחית ​​להצמיח תאים תחושתיים nonsensory בתוך האוז?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מקרה עיקור Micro </td><td> ROBOZ </td><td> RS-9900a </td><td> 8X8.5X1.25 אינץ&#39; </td></tr><tr><td> הכדור שקצהו מספריים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 14109-09 </td><td></td></tr><tr><td> טבעת מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11106-09 </td><td> 4.8mm ID/6mm OD </td></tr><tr><td> Adson מלקחיים רקמות </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> מחט הנהג </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק אלרגיה מגש </td><td> בקטון Dickison </td><td> 305536 </td><td></td></tr><tr><td> תפר 6-0 </td><td> Syneture </td><td> GL-889 </td><td> 0.7 תפר העיכול מדד </td></tr><tr><td> לקטט רינגר של הזרקת USP </td><td> בקסטר </td><td> 2B2323 </td><td></td></tr><tr><td> מהיר ירוק </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> ההתכה של זכוכית בורו נימי </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 30-0053 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן נמבוטל פתרון </td><td> תשואות פרמצבטיקה בע&quot;מ </td><td> NDC 67386-501-52 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO4.7H2O </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> M63-500 </td><td></td></tr><tr><td> פרופילן גליקול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> P355-1 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> E7023-500 </td><td></td></tr><tr><td> Meloxicam </td><td> Boehringer Ingeheim </td><td> נדא 141-219 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette פולר </td><td> סאטר מכשירים </td><td> P-97 </td><td> FB255B נימה התיבה, להתייעץ עם ספר מתכונים פיפטה ממכשירים סאטר </td></tr><tr><td> Microelectrode Beveler </td><td> סאטר מכשירים </td><td> BV-10 </td><td> הדיסק beveling 104C עבור בטפי להחדרת נוזלים גדולות; עיין במדריך של הבעלים של beveling התיאוריה </td></tr><tr><td> Micropipette בעל </td><td> וורנר מכשירים </td><td> MP-S15T </td><td> על פיפטה 1.5mm קוטר חיצוני ויציאת לחץ נקבה צינורות Picospritzer. </td></tr><tr><td> פינצטה בסגנון האלקטרודה </td><td> PROTECH בינלאומי בע&quot;מ </td><td> CUY650P5 </td><td> 5 מ&quot;מ קוטר חיצוני </td></tr><tr><td> כיכר גל Electroporator </td><td> PROTECH בינלאומי בע&quot;מ </td><td> CUY21EDIT </td><td> Footpedal המומלצת </td></tr><tr><td> PICOSPRITZER III </td><td> פארקר Hannifin </td><td> 051-0500-900 </td><td> Footpedal המומלצת </td></tr><tr><td> שליטה ידנית micromanipulator </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 640056 </td><td></td></tr><tr><td> למינרית אופקי תזרים נקי הספסל </td><td> Envirco </td><td></td><td> שינויים מותאמים אישית ל 630-10554 LF. ראה מידע משלים סכמטי מכסה המנוע. </td></tr><tr><td> לייקה stereofluorescence לנתח microcope עם מנוע Lumencor אור סולה </td><td> Bartels, המוצק Lumencor </td><td> MZ10F עם מנוע Lumencor אור סולה </td><td> Footpedals למקד את MZ10F וכדי לעורר את המנוע אור סולה מומלצים </td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 594 dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D22913 </td><td> מימית 10mg/ml, </td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 488 dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D22910 </td><td> מימית 10mg/ml, </td></tr><tr><td> Enviro-DRI </td><td> שפרד פאפ מיוחדיםERS </td><td></td><td> <a href="http://www.ssponline.com" target="_blank">www.ssponline.com</a> </td></tr></tbody></table>

gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation

האוזן הפנימית יונקים יש 6 epithelia חושית ייחודית: 3 cristae ב ampullae של תעלות בצורת חצי עיגול, maculae ב utricle ו שקיק, ואת האיבר של קורטי ב שבלול מפותל. Cristae ו maculae מכילים תאים שיער וסטיבולריות כי transduce גירויים מכניים כדי subserve תחושה מיוחדת של איזון, בעוד שיער השמיעה התאים איבר של קורטי הם מתמרים העיקריות לשמוע 1. גורל התא הפירוט epithelia אלה המורפוגנזה חושית של התעלות ושל בצורת חצי עיגול שבלול להתקיים בשבוע השני של ההריון של העכבר הושלמו בעיקר לפני הלידה 2,3. מחקרים התפתחותיים של האוזן הפנימית העכבר נעשות באופן שגרתי על ידי איסוף עוברים מהונדס בשלבים עובריים או לאחר לידה שונים כדי לקבל תובנה על הבסיס המולקולרי של הסלולרי ו / או פנוטיפים מורפולוגי 4,5. אנו משערים כי העברת גנים לאוזן העכבר בפיתוח הפנימי ברחם &lt;<html> / Em&gt; בהקשר של רווח והפסד של תפקודי מחקרים מייצג גישה חינם ל transgenesis העכבר המסורתי לחקירה של המנגנונים הגנטיים העומדים בבסיס האוזן יונקים הפיתוח הפנימי 6. פרדיגמה ניסויית לנהל misexpression מחקרים גנים באוזן העכבר פיתוח פנימי הוכיח כאן פותר לשלושה שלבים כלליים: 1) laparotomy הגחון; 2) microinjection transuterine, ו 3) ב electroporation vivo. Laparotomy הגחון הוא ההישרדות העכבר טכניקה כירורגית המאפשר החצנה של הרחם כדי לקבל גישה ניסויית על העוברים המושתלים 7. Microinjection Transuterine הוא השימוש, micropipettes משופעים זכוכית נימי להציג את הביטוי הפלסמיד לתוך לומן של שלפוחית ​​otocyst otic או. בחי electroporation הוא יישום של גל מרובע, קטניות השוטפות הניתנות באופן ישיר לנהוג ביטוי הפלסמיד לתוך 8-10 ובתאים. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; אנחנו קודם לכן תיאר את electroporation מבוססת טכניקת העברת גנים כלל הערות מפורטות על כל צעד של פרוטוקול 11. טכניקות עכבר העוברית הניסוי יכול להיות קשה ללמוד פרוזה תמונות סטילס בלבד. במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים את 3 השלבים בהליך העברת גנים. הכי קריטי, אנחנו לפרוס מיקרוסקופיה וידאו דיגיטלי להראות בדיוק איך: 1) לזהות את האוריינטציה העובר ברחם; 2) לארגון מחדש של עוברים למיקוד זריקות כדי otocyst; 3) microinject DNA מעורבב עם פתרון צבע נותב אל otocyst על ימים עובריים 11.5 12.5: 4) electroporate otocyst מוזרק, ו 5) עוברים תווית electroporated לבחירה לאחר הלידה בלידה. אנו מספקים דוגמאות מייצגות של האוזניים הפנימיות transfected בהצלחה: מדריך מצולם על הסיבות השכיחות ביותר של Mistargeting otocyst, לדון כיצד ניתן למנוע טעויות מתודולוגיות משותפות וכן הנחיות לכתיבת הנוכחיים ברחם גרםטיפול בבעלי חיים מז העברת הפרוטוקול.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation at JoVE.com

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו מגדירים<em&gt; ברחם</em&gt; העברת גנים הטכניקה המורכבת משלושה שלבים: laparotomy העכבר הגחון, microinjection transuterine, ו<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation. אנו משתמשים במיקרוסקופ וידאו דיגיטלי להדגים טכניקות קריטיים העוברית ניסיוניים.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

gene-transfer-to-developing-mouse-inner-ear-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

13.9K Views.  Oregon Health & Science University. האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו מגדירים ברחם העברת גנים הטכניקה המורכבת משלושה שלבים: laparotomy העכבר הגחון, microinjection transuterine, ו In vivo Electroporation. אנו משתמשים במיקרוסקופ וידאו דיגיטלי להדגים ט?...

Video: Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

ג&#39;ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and genetic mechanisms that contribute to hearing loss. Introduction of vectors into the inner ear must be done in a way that widely distributes the agent throughout the cochlea while minimizing injury to the existing structures. This manuscript describes a post-auricular surgical approach that can be used for mouse cochlear therapy using molecular, pharmacologic, and viral delivery to mice postnatal day 10 and older via the round window membrane (RWM). This surgical approach enables rapid and direct delivery into the scala tympani while minimizing blood loss and avoiding animal mortality. This technique involves negligible or no damage to essential structures of the inner and middle ear as well as neck muscles while wholly preserving hearing. To demonstrate the efficacy of this surgical technique, the vesicular glutamate transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) mice will be used as an example of a mouse model of congenital deafness that recovers hearing after delivery of VGLUT3 to the inner ear using an adeno-associated virus (AAV-1).

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...