אנו מכירים את התרומות סוג של זני חיידקים מן הקבוצות של פרופ &#39;יהודית ארמיטג&#39; (אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה), פרופ&#39; קונרד Mullineaux (המלכה מרי באוניברסיטת לונדון, אנגליה). IMD ממומנת במשותף על ידי המחלקה לביוכימיה (אוניברסיטת אוקספורד) ו OCISB: AR ממומנת על ידי הנדסה המדעים הפיזיקליים המועצה למחקר (EPSRC) מלגת הלימודים DTC; ND ממומנת מן ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC); MCL הוא במימון מלגה החברה המלכותית מחקר באוניברסיטה.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בהליך זה, 50 μl של מניות קפוא של חלבון פלואורסצנטי להביע coli Escherichia תאים חיידקיים הם מפשיר הראשון גדלו aerobically עם רועד 5 מ&quot;ל LB התקשורת צמיחה לילה ב 37 מעלות צלסיוס בבוקר, 50 μl של תרבות זו רווי מופק ותת תרבות מינימלית M63 לתוך תרבות מדיה גלוקוז, דוגרים ב-C 30 מעלות למשך 4 עד 6 שעות. כאן אנו מדגימים באמצעות שני זני תאים שונים, אשר אחד מהם מבטא העברת אלקטרונים ציטוכרום התמזגו GFP, השני המבטא חלבון מעורב המנוע flagellar חיידקי התמזגו GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עשויים לקצור במישרין מן התרבות קטן גדל אם הצפייה בהם דגימות משותקת, או שהם עשויים להיות טעון לחתוך שוטונים חיידקי אם צפייה בתנאים &quot;קשור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שירינג כרוך בדרך כלל הצבת 1-5 מ&quot;ל של תרבות המשנה לתוך מכשיר המורכב משתי מזרקים סטריליים הצטרפו צנרת סטרילית. הגז נעשית על ידי לסירוגין דוחפים משאבה כל מזרק כדי לדחוף את תרבות דרך צינור צר. הדבר נעשה 5-10 פעמים, בהתאם להיקף הגז הנדרשת. תרבות היא centrifuged אז גלולה התאים, אשר resuspended בתקשורת מינימלי להסיר שברי שוטונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן אנו מכינים לנקות BK7 coverslips זכוכית ידי טבילה בתמיסה רוויה של KOH באתנול במשך 20 דקות, ואז לשטוף ביסודיות במים דה מיונן אתנול ולהשאיר לייבוש באוויר לפחות 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו פשוט לבנות תזרים תאים לבית התאים במיקרוסקופ. זה כרוך ציור קווים של שומן פרפין על שקופית BK7 מיקרוסקופ זכוכית ולאחר מכן יצירת מנהרה-כריך ידי הצבת אחד coverlips ניקו למעלה, ולחיצה מטה בעדינות עם זוג מלקחיים, נותן נפח תא זרימה של μl 5-10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לצפות בתאים משותקת אנחנו ממלאים את זרימת תאים בזריקה עם פתרון w / v 0.1% פולי-L-ליזין, ולאפשר לו דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקות לפחות 1. לאחר מכן לשטוף החוצה באמצעות מדיה מינימלי 100 μl ידי הזרקת התקשורת מקצה אחד של התא זרימה ועל הפתילה בנייר טישו מהשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, אנו הפתיל דרך μl 20 של דילול 1:500 בקוטר של 200 ננומטר לטקס microspheres (Polysciences) בתקשורת מינימלי כדי לסמן את השטח coverslip. זרימת תאים הוא הפוך כזה coverslip פונה כלפי מטה, מונח על מצע ברור של השטח בתא לחות פשוט, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. חרוזים מאוגד נשטפים אז במרחק של 100 הפתילה דרך התקשורת מינימלי μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אנו רוצים לשמור התאים קשורים אנו להשמיט את הצעד poly-L-ליזין, ובמקום למלא את זרימת תאים עם נוגדן אנטי flagellin 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. זרימת תא הוא מקום בתא לחות במשך 10 דקות, והוא הסמיק מכן דרך על ידי הפתילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl של התרבות התא ואז הרשעים דרך התא זרימה, בין אם באמצעות מדגם טעון התבוננות אם התאים קשורים או מדגם unsheared ב צפייה תאים משותקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת תאים היא הפוכה והניח בתא לחות עבור 20 דקות. תאים מאוגד נשטפים החוצה ואז על ידי מדיה הפתילה דרך 100 μl מינימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפה של שמן טבילה ממוקם במרכז המשטח העליון של coverslip ואת זרימת תאים ממוקם אז בעדינות לבעל המדגם של מיקרוסקופ פלואורסצנטי המנהג בנוי, ביצירת קשר עם עדשה אופטית מטרה גבוהה מספרי הצמצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצלמה מיקרוסקופ אלקטרונים הכפלת מופעל ונמצא המצלמה מוגדר להיות מקורר -70 מעלות צלזיוס, התוכנה מוגדרת לרכוש תמונות בקצב מסגרת טיפוסית של 25 הרץ במצב מסגרת העברה, בתחילה disenabling לקבל שליטה על המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאורה brightfield מופעל ואת התמונה הוא הביא אל המוקד, בחירת תא או קבוצת תאים מתאים להיות צילמו על בסיס היותם תקועים עם מקביל לציר הארוך שלהם אל פני השטח coverslip. הדגש הוא מותאם היטב על מנת להבטיח כי לטקס 200 ננומטר חרוזים תקוע אל פני השטח coverslip הם רק בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף התמונה היא רכשה brightfield להקליט את קווי המתאר של גוף התא. תאורה brightfield הוא כיבה את המצלמה מופעלת רווח מרבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רכישת תקן באמצעות השתקפות מסך פלואורסצנטי פנימי (או TIRF) קרן לייזר על הגל המתאים (כאן, עירור ירוק חלבון פלואורסצנטי, אנו משתמשים לייזר 473 ננומטר) היא שנקבע מראש כדי להיות ממוקד במישור המוקד האחורי של העדשה אובייקטיבי אבל העקורים רוחבית מהציר האופטי כדי ליצור שדה חלוף עבור עירור הקרינה לתוך המדגם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכישה המצלמה התחיל את התריס נפתח לייזר כדי להלהיב את חלבוני ניאון בתוך החיידק. הפרמטרים עבור עוצמת הלייזר ואת המהירות של הרכישה צריך להיות מותאם למערכת ביולוגית מסוימת תחת חקירה על ידי התנסות עם ערכים שונים, אלא מגוון טיפוסי relevant ללימוד קומפלקסים חלבונים ניידים קרום התא הם 1-10 כוח mW הלייזר על פני שטח עירור עגולה בקוטר ~ 30 מיקרומטר, עם זמן חשיפה לכל מסגרת של 50-40 אלפיות השנייה. דוגמאות מוארים עד photobleached, בדרך כלל עבור ~ 10 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור תאים קשור בו גוף התא הוא מסתובב על נקודת ההתקשרות בין coverslip ועל בדל flagellar, ועל תאים משותקת אשר קבועים ונוקשים אל פני השטח coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה זנים התא שבו יש מספר גבוה עותק של קומפלקסים תועלת אקונומיקה הראשונית עקיפה מוגבל לייזר ממוקדת על מוט אחד של התא לפני TIRF הדמיה. אקונומיקה זה שווה כי בשימוש התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (או FRAP). באמצעות מיקרוסקופ המנהג שלנו קצת אור לייזר עירור יכול להיות מוזן לתוך נתיב עצמאי second המשמש FRAP מסוג הלבנה. בדרך כלל 1-10mW כוח לייזר משמש, עם זמן אקונומיקה טיפוסי בטווח 10-300 מילישניות. התוצאה היא הרבה יותר גבוהה לעומת הדמיה באזור מולבן של התא ומאפשר מתחמי יחיד אשר לאחר מכן מפוזר לאזור זה יהיה בקלות רבה יותר דמיינו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חזותי מתחמי בציטופלסמה של התא אשר מפוזר הרבה יותר מהר מאשר אלה קרום התא מצב תאורה שונים בשם &quot;slimfield&quot; הוא מועסק. הנה לייזר ממוקדת מורחבת רוחבית כדי להקיף רק תא בודד. זה מייצר שדה חזק מאוד ומאפשר חשיפה הרבה יותר מהר בדרך כלל של אלפית השנייה להילקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הרכישה נתונים, תמונות מוזנים לתוך התוכנה כתובה מותאמת אישית (מקודד LabVIEW 8.5). זה מזהה אוטומטית את עמדות נקודות פלורסנט בתאים עד לדיוק של ננומטרים ספורים בדרך כלל ותמציות גודלם ואת הבהירות. Brightnessof עקבות photobleaching ביחס לזמן ממכלול מולקולרית מעקב לאחר מכן נעשה שימוש כדי להעריך את stoichiometry, כלומר כמה חלבוני ניאון הפרט לפצות קומפלקס מולקולרי יחיד. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה את התמונות של התאים שנצפו ב brightfield שונה מאוד, עם היקפה של גופי התא כהה נגד גוף תא לבן / אפור (איור 1 א). ב הקרינה משותקים באמצעות תאים, אנו יכולים לראות עוצמת כתמים ברורים, בדרך כלל של 250-300 ננומטר רוחב (איור 1b). בריאים, התאים קשורים יראו לסובב סביב נקודת ההתקשרות לקשור בתמונות brightfield. תחת עירור הקרינה מתחמי כמה מולקולרית במקרה שלנו יכול להיות גם לראות בנקודת ההתקשרות, מה שמעיד על לוקליזציה של החלבון מתוייגים עם המנוע flagellar. כתמים אלה הם קומפלקסים מולקולריים בודדים ומספר להם לראות יהיה תלוי במצב תאורה המשמשים וכמה מתחמי הם בעצם להציג בתא בכל רגע נתון. הניידות של כתמים תלוי מערכת ביולוגית ספציפית תחת מחקר. אם את הצפיפות של הנקודות בהתחלה הוא גבוה מאוד, כפי שקורה עם cytochromes שכותרתו משמש כאן, ולאחר מכן ביצוע אקונומיקה FRAP הראשוני יכול לשפר את הניגודיות הדמיה. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="איור 1" /> באיור 1. (א) brightfield ו (ב) התמונה TIRF (צבע שקר) עבור תא Escherichia coli משותקת לבטא חלבון התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אשר ידוע להיות מעורב המנועים flagellar של חיידקים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

<ol>
	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

יש להקפיד שלא &quot;על גזירה&quot; התא מסתכל חיידקים קשור, שכן הדבר עשוי לפגום את הפונקציונליות של מנועים flagellar. חשוב להשתמש בתאי הרבה יותר משעה אחת בשקופית מיקרוסקופ שכן הם עלולים להפוך חמצן מדולדל. אופטימיזציה ניכרת ייתכן שיהיה צורך למצוא הדמיה את התנאים הטובים ביותר מי?...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

התובנה המלאה לתוך המנגנונים של תאים חיים יכולה להיות מושגת רק על ידי חוקר את תהליכי המפתח לעורר ולכוון אירועים ברמה התאית. עד כה מורכבות גזירה של מערכות ביולוגיות גרמה ניסויים מדויקים מולקולה בודדת להיות תובעני מדי, במקום התמקדות במחקרים של מערכות יחיד באמצעות בתפזורת גולמי יחסית ההרכב הממוצע מדידות. עם זאת, תהליכים חשובים רבים המתרחשים בתא החי ברמה של רק אחת או כמה מולקולות; מדידות ההרכב כלל להסוות את טבעו סטוכסטיים והטרוגניות של אירועים אלה. כאן, בעזרת מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת כלי ניתוח אנליטיים תמונה אנחנו מדגימים כיצד לפקח חלבונים בתוך תא חי בודד החיידק עד לדיוק של מולקולות בודדות וכיצד אנו יכולים לצפות הדינמיקה בתוך קומפלקסים מולקולריים בתפקוד מכונות ביולוגיות. טכניקות רלוונטיים ישירות פיזיולוגית. הם מינימלית perturbative ולא פולשנית המדגם ביולוגי תחת לימוד מכוונים באופן מלא בחקירות בחומר חי, תכונות לא זמינים מולקולה בודדת גישות אחרות של ביופיזיקה. בנוסף, דגימות ביולוגיות למד לייצר כל חלבון fluorescently-tagged ברמות אשר כמעט זהים לצלילי תא ללא שינוי (&quot;הקידוד הגנומי&quot;), בניגוד לגישה נפוצה יותר אך פחות אידיאלי להפקת חלבון משמעותי יותר היה להתרחש באופן טבעי (&#39;פלסמיד ביטוי &quot;). לפיכך, בפועל דגימות ביולוגיות אשר תיחקר באופן משמעותי קרוב יותר אורגניזמים טבעיים, ולכן התצפיות רלוונטי יותר תהליכים פיזיולוגיים אמיתי.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

9.2K Views.  University of Oxford. כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

Video: Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Medicine

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Neuroscience

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Biochemistry

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Super-resolution Fluorescence Microscopy

Super-resolution fluorescence microscopy (SRFM) provides a better resolution than conventional fluorescence microscopy by reducing the point spread function (PSF). PSF is the light intensity distribution from a point that causes it to appear blurred. Due to PSF, each fluorescing point appears bigger than its actual size, and it is the PSF interference of nearby fluorophores that causes the blurred image. Various approaches to achieving higher resolution through SRFM have recently been developed.
Photoactivated Localization Microscopy
Photoactivated localization microscopy (PALM) is a type of fluorescence microscopy that captures high-resolution images using a single-molecule detection and localization approach. For example, two fluorescent spots 75 nm apart may appear to be a single spot during imaging due to interference of their PSFs. In such cases, especially for live-cell imaging, PALM is a suitable technique to resolve the interference and provide a better resolution.
In PALM, a variant of green fluorescent protein (GFP) with a different excitation wavelength and high fluorescence is employed. In the first step, a few GFPs are activated and imaged with very high precision. In the next step, another set of GFPs is activated and imaged. Step by step, all the GFPs across the specimen are thus recorded. Finally, the data is processed to generate a high-resolution image.
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
In stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), unique photo-switchable probes are used for specimen imaging. The emission from these probes can be switched on and off using lights of different wavelengths. Thus, only a few fluorophores can be activated at a point in time such that the number of activated fluorophores is significantly lesser than the number of deactivated fluorophores. This selective activation of probes helps determine their precise position in the specimen. Following this, the center of each fluorescent probe is identified and marked. The process is then repeated to record all the fluorescent probes in the specimen. Finally, a high-resolution composite image is constructed by superimposing these multiple images.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה מעולה

Super-resolution fluorescence microscopy (SRFM) provides a better resolution than conventional fluorescence microscopy by reducing the point spread ...