המחברים מודים RIKEN למימון. אנו מודים גם Cagri Yalgin, קרוליין Delandre, וג&#39;יי פריש לדיונים על פרוטוקולים גנטיים אימונוהיסטוכימיה.

1.Preparation של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Ca + + ללא HL3.1 מלוחים 28. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במ&quot;מ: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 סוכרוז, ו 5 trehalose; pH 7.2. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. הערה: Ca + + ללא פתרון המונע התכווצות שרירים במהלך לנתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פולי-L-ליזין (PLL) coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 100 מ&quot;ג PLL במים 4.2ml ולעשות aliquots 300μl צינורות Eppendorf ולהקפיא ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני coverslips ציפוי, להפשיר הראשונה בה aliquot, ולהביא אותו עד 10 מ&quot;ל ב DDH 2 O ולהוסיף 20μl של Kodak Photo-פלו; ריכוז PLL הסופית היא 0.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips לצלול עבור 30mins בפתרון PLL, להסיר ויבש, ולאחר מכן לשטוף עם מים לזמן קצר ויבש. חזור פעמיים. המטופלים coverslips האחרון כחודש. </li></ol></li></ol> 2. חוצה גנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> To ליצור שיבוטים MARCM. הנה דוגמה לחצות באמצעות הנהג הפאן התובע 11,27: FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, כטב&quot;מ-mCD8: ה-GFP, גיגית, Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור Flp-out שיבוטים. הנה דוגמה לחצות באמצעות הנהג IV ספציפיים בכיתה 8: פ.פ.ק. Gal4 x-YW, hsFLP; כטב&quot;מ-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8: GFP </li></ol> 3. אוסף של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור חוצה תסיסנית בבקבוק אוסף של 25 ° C ו לאסוף עוברים על התפשטות אגר מיץ תפוחים 29 צלחת בשכבה דקה של ממרח שמרים 30,31. </li></ol> 4. הלם חום טיפול של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת ריקה בניגוד צלחת אגר מיץ תפוחים שעליו עוברים נקבעו. חותם סביב אלה שתי צלחות עם Parafilm (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הלם חום, לצלול הצלחת דואר באמבט מים והחזק אותו באמצעות משקולת מתכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברי MARCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים 2h ו דגירה בצלחת פטרי 10 ס&quot;מ מוקף לחלח ברקמות של 25 מעלות צלזיוס במשך 2h נוספים. הערה: התאמת פרוטוקול הלם החום משנה את התדירות שבה הם שיבוטים שנוצרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך מספר קטן יותר של שיבוטים, מכוון נוירונים בודדים בודד, לצלול הלם החום באמבט מים 1h ב 38 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מספר גדול יותר של שיבוטים, הלם חום עבור 45mins ב 38 ° C, ולשחזר את 30mins RT, אז הלם החום שוב 30mins נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף Flp-out עוברים 24 שעות, ו הלם החום 1h ב 38 ° C. </li></ol> 5. הקרנת עבור שיבוטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ההלם חום, להסיר את המכסה של ההסדר האטומה למים והמקום צלחת אגר מיץ תפוחים בצלחת פטרי 10 ס&quot;מ מוקף ברקמות לחלח. התרבות עוברים הזחלים לאחר מכן ב 25 ° C עד לנדודing 3 rd instar. הערה: התנאים תרבות, במיוחד תזונה, הוכחו לשנות התובע הדנדריטים מורפולוגיה סוכת 32,33. ודא כי הזחלים גדל גישה להדביק שמרים בכל עת, לפקח לחדש את השמרים להדביק כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו ואילך בפרוטוקול, לתמרן בעדינות באמצעות מלקחיים זחלי חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה בעדינות ולשטוף את הזחלים במי ברז ולאחר מכן מקום לצלחת אגר. הערה: צעד זה מפחית את הקרינה רקע אוטומטי מהמזון או לכלוך על פני הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הזחלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי חזק לנתח. זיהוי הזחלים עם GFP חיובי נוירונים / תאים בדופן הגוף. </li></ol> 6. הדמיה in vivo של דנדריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל לתוך כוס שקופית דיכאון עם טיפה קטנה של גליצרול 80%. מניחים coverslip בשקופית כדי לשתק את הזחל. ודא כי לא נותר אוויר בין הזחל לבין coversliעמ &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות את coverslip לגלגל את הזחל כדי לאפשר ויזואליזציה של הנוירון של עניין. תמונת mCD8: GFP שכותרתו סוכת הדנדריטים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 7. הזחל לנתיחה הערה לפני שמתחילים: התובע דנדריטים נוירון לבזות במהירות לאחר תחילתו של דיסקציה. לנתח כל זחל בודדים פחות 5min כדי להבטיח מורפולוגיה דנדריט טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נדודים 3 rd הזחלים instar על צלחת Sylgard כפי שתואר לעיל 34 בשינויים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה של התובע נוירון האקסון טרמיני, להבטיח כי מערכת העצבים המרכזית הוא שלם את העצבים סגמנטלי לא שבורים. לאחר פתיחת זחלים, תחילה בזהירות לחתוך את הקשרים קנה הנשימה אל הקיר הגוף ואז בעדינות להסיר את הבטן כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה דנדריטים לבד, להסיר את מערכת העצבים המרכזית לאפשר להחמיא גובר. </li></ol></li></ol> 8. Fixatיונים חסימת פילה הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הזחל ניצח עדיין הצלחת Sylgard, לתקן את זה PFA 4% PBS עבור 20mins ב RT על שייקר בעדינות מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עקבות של רקמות הזחל (שומן הגוף, הנשימה וכו &#39;) לאחר קיבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ב PBST (PBS עם 0.1% טריטון X-100) 10mins 3x על צלחת Sylgard ו שייקר. אם בוחנים Termini האקסון, לשמור על פילה בצלחת Sylgard. (אם דנדריטים מכתים אפשר להעביר את פילה הזחל אל צינור 0.5 מ&quot;ל בשלב זה 34) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הזחלים עבור 20mins ב RT ב 5% נורמלי חמור בדם (NDS) ב PBST על שייקר. </li></ol> 9. הכתמה של פילה הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון חסימת דגירה של הנוגדן הראשוני (ב 5% NDS / PBST) לילה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל פלסטיק קטן מוקף לחלח רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מתוך 4 ° C ו דגירה שעה נוספת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 10mins 6x ב PBST. מוסיפים את antib משניody (ב 5% NDS / PBST), ומכסים על מנת למנוע צילום הלבנת fluorophore 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה או ב RT במשך שעתיים, או לילה ב 4 ° C ואחריו שעה אחת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את 10mins הזחלים 6x ב PBST והמשך גובר. </li></ol> 10. הרכבה של פילה הזחל לבדיקה של סוכת דנדריט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל פילה הזחל ישר ככל הניתן באמצעות מספריים או אזמל מנתחים לנתק את הראש (כולל ווים הפה), ואת האחורי (כולל spiracles) 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פילה הזחל בשקופית לציפורן בצד למטה, לעלות ב 80% גליצרול ו לאטום את הצדדים של coverslip עם לק על &quot;מהיר&quot; הר 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרכבה קבוע תמונה ברורה יותר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פילה גזור הזחל שרירים בצד למטה על ירידה של PBS על coverslip PLL, זה יהיה מהר לדבוק coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כנוזל רב ככל האפשר לאחר הרכבה, however לא לאפשר לו להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את coverslip (עם פילה הזחל המצורפת) באמצעות סדרה אתנול: אתנול 35%, ואחריהם 50%, 70%, 95% ו 100% אתנול 2x בסופו של דבר כל אחד במשך 10 דקות (את פתרון 2 100% EtOH צריך להיות שונה לעיתים קרובות ;) סוף סוף, לשטוף 2-3x 10mins ב קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים טיפת DPX mountant (קסילן Distyrene plasticizer) בשקופית נקי בזהירות להניח את coverslip פילה בצד למטה למעלה. שמור בחושך, ולהמתין יום אחד עבור DPX להגדיר לפני הדמיה. </li></ol></li></ol> 11. הרכבה של פילה הזחל לבדיקה של Termini האקסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העצבים סגמנטלי רץ בין PNS ו CNS ללא פגע במהלך קיבעון לנתיחה, והכתים כדי לאפשר מעקב של אקסונים מן הפריפריה גוף תא עצב תחושתי על VNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל הזחל פילה לציפורן בצד למטה גליצרול 80% שקופית דיכאון. עקוב אחר אקסונים מגוף התא אל התובעVNC תחת מיקרוסקופ confocal. הערה: PNS הנוירונים בכל פרויקט קיר גוף קטע לקטע מאותו מקור של VNC. </li></ol> 12. נציג תוצאות: תוצאות נציג מוצגות דמויות 3-5. איור. 3 מציג את סוכת שלמה של IV בכיתה דה נוירון, שנתפסו in vivo תחת מיקרוסקופ confocal. איור. 4 מראה תקריב של חלק סוכת דנדריט של המעמד השלישי שכותרתו immunohistochemically נוירון כי תוקנה כראוי כדי לשמור על המורפולוגיה. הבלעה הקשורים מציגה את השפלה שעלול להתרחש לאחר דיסקציה כושל ועל קיבעון (שניהם מוכתמים נוגדן אנטי-GFP). איור. 5 מראה בכיתה אחת IV האקסון הסופית של מערכת העצבים המרכזית (אנטי GFP, ירוק); כל IV Termini בכיתה הם שיתוף מוכתם אנטי CD2 (מג&#39;נטה). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg" /> איור 1 סקירת הפרוטוקול. א) איסוף ולאחר מכן חום עוברים זעזוע. ב)<html> בחר הזחל עם GFP חיובי התובע נוירון לשבט, ואז התמונה GFP שכותרתו דנדריט סוכה הזחל לחיות. ג) מנתחים את הזחל, ולאחר מכן immunohistochemically הכתם פילה. ד) הר פילה מוכתם, ואז התמונה סוכת הדנדריטים ותחזיות axonal של נוירון התובע שיבוטים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg" /> איור 2 הכנת צלחת אגר מיץ תפוחים להלם חום. קחו את הצלחת (חץ לבן, א.ב.), להוסיף המנה השנייה פטרי על גבי (אדום חץ ב) ו חותם מסביב עם Parafilm (חץ כחול, ב). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg" /> איור 3 בתמונה vivo של סוכת דנדריט של mCD8: GFP שכותרתו שיבוט MARCM (גנוטיפ כמו 2.1) המייצג הרביעי בכיתה (v&#39;ada) הנוירון של הזחל instar 3 rd. סרגל קנה המידה 50μm. d/3111/3111fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4 mCD8: GFP שכותרתו שיבוט MARCM של המעמד השלישי נוירון (ddaA) מוכתם נוגדן אנטי-GFP, מראה מורפולוגיה טוב לאחר דיסקציה קיבעון מוצלח (ירוק). מראה הבלעה השפלה דנדריט (חצים לבנים) המתרחשים לאחר דיסקציה קיבעון נכשל (מג&#39;נטה). סרגל קנה המידה 25μm. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg" /> איור 5 3 rd instar הזחל VNC. שיבוט Flp, מתוך מסוף יחיד בכיתה ו האקסון (vdaB) (גנוטיפ כמו 2.2) הוא זוהה באמצעות נוגדן אנטי-GFP (ירוק). Anti-CD2 כל התוויות IV בכיתה טרמיני (מג&#39;נטה). סרגל קנה המידה 25μm.

<ol>
	<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila:+the+role+of+Collier.">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315, 232-242 (2008).</li><li>Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+Knot/Collier,+a+transcriptional+regulator+of+the+EBF/Olf-1+family,+endows+the+Drosophila+sensory+system+with+neuronal+class-specific+elaborated+dendritic+patterns.">Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns.</a> Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).</li><li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li><li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt.">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43, 809-822 (2004).</li><li>Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTB/POZ-zinc+finger+protein+abrupt+suppresses+dendritic+branching+in+a+neuronal+subtype-specific+and+dosage-dependent.">BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent.</a> 43, 823-834 (2004).</li><li>Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+specification+of+axonal+arbors:+atonal+regulates+robo3+to+position+terminal+branches+in+the+Drosophila+nervous+system.">Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system.</a> Neuron. 37, 41-51 (2003).</li><li>Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrites+of+distinct+classes+of+Drosophila+sensory+neurons+show+different+capacities+for+homotypic+repulsion.">Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion.</a> Curr Biol. 13, 618-626 (2003).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons.">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112, 805-818 (2003).</li><li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hamlet,+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology.">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology.">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).</li><li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington's+Disease-Like+Model.">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Larval+CNS+in+Drosophila+Melanogaster.">Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Merritt, D. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+neurons+in+the+Drosophila+embryo+correlate+with+sensory+modality,+soma+position,+and+proneural+gene+function.">Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function.</a> J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development.">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+representation+of+the+glomerular+map+in+the+Drosophila+protocerebrum.">Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum.</a> Cell. 109, 229-241 (2002).</li><li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen:+origins,+dendritic+morphology,+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death.">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural Dev. 4, 37-37 (2009).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+Embryonic+Nervous+System+in+Whole-mount+Drosophila+Embryos.">Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster.">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li><li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress.">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry.">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons.">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+the+Drosophila+neuropile:+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites.">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזחל תסיסנית מודל התובע נוירון מספקת מערכת אחת גנטי מעולה לחקור מנגנוני בקרה נוירון מורפולוגיה היווצרות מעגל. MARCM משמש בדרך כלל עבור תיוג ליצירת מוטציה התובע שיבוטים נוירון. עבור MARCM אנו משתמשים או מחבת-עצביים (למשל Gal4 c155) או התובע נוירון ספציפי הנ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> SZX16 לנתיחה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עם GFPHQ לסנן) </td><td> אולימפוס </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> חיים מלקחיים חרקים </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm x 76mm דיכאון שקופיות זכוכית </td><td> Toshinriko ושות </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (או Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P-1524 </td><td> מוצר זה הוכח כיעיל ביותר </td></tr><tr><td> DPX הרכבה בינונית </td><td> סיגמא </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד ה-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> עכברוש אנטי CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי CD2 </td><td> AbD serotec </td><td> MCA443R </td><td> דילול 1:700 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> דילול 1:10 </td></tr></table>

morphological analysis of drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics

התפתחות מערכת העצבים מחייב את המפרט הנכון של נוירון עמדה וזהות, ואחריו התפתחות דנדריטים מדויק בכיתה ספציפית נוירון וחיווט axonal. לאחרונה הדנדריטי (DA) arborization עצב סנסורי של המערכת תסיסנית הזחל העצבים ההיקפית (PNS) הפכו מודלים גנטי חזק שבו להבהיר שני מנגנונים כלליים בכיתה ספציפית של בידול נוירון. ישנם ארבעה הראשי התובע כיתות נוירון (I-IV) 1. הם שם לפי סדר המורכבות הגוברת סוכת דנדריט, יש מעמד ספציפי ההבדלים בשליטה הגנטי של בידול שלהם 20-10. המערכת החושית התובע הוא מודל מעשי לחקור את המנגנונים המולקולריים מאחורי שליטתה של מורפולוגיה הדנדריטים 11-13 כי: 1) הוא יכול לנצל את הכלים גנטי חזק זמין זבוב הפירות, 2) התובע דנדריט נוירון סוכת פורשת רק 2 מימדים מתחת אופטית CLEלציפורן ar הזחל ולכן קל לדמיין עם רזולוציה גבוהה in vivo, 3) את המגוון בכיתה ספציפית במורפולוגיה הדנדריטים מאפשרת ניתוח השוואתי למצוא אלמנטים מרכזיים שליטה על היווצרות של עצים דנדריטים פשוט מול מסועפת מאוד, 4) סוכת הדנדריטים סטריאוטיפיות צורות שונות של נוירונים התובע להקל על ניתוחים סטטיסטיים morphometric. פעילות התובע נוירון משנה את הפלט של גנרטור דפוס הזחל מרכזי תנועה 14-16. שונה התובע כיתות נוירון יש שיטות שונות חושית, והפעלה שלהם מעוררת תגובות התנהגותיות שונות 14,16-20. מעמדות שונים ועוד לשלוח תחזיות axonal סטריאוטיפי לתוך מערכת הזחל תסיסנית מרכזי העצבים בחוט עצב הגחון (VNC) 21. תחזיות אלו לסיים עם ייצוגים הטופוגרפי של מודליות הן התובע נוירון חושי את המיקום בקיר גוף השדה הדנדריטים 7,22, 23. לפיכך, בחינה של תחזיות התובע axonal יכול לשמש כדי להבהיר המנגנונים מיפוי טופוגרפי 7,22,23, כמו גם את החיווט של תנועה הזחל פשוט ויסות מעגל 14-17. אנו מציגים כאן מדריך מעשי ליצור ולנתח פסיפסים גנטי 24 נוירונים סימון התובע באמצעות MARCM (ניתוח פסיפס עם מרקר תא Repressible) 1,10,25 ו Flp-out 22,26,27 טכניקות (מסוכם באיור. 1).

Watch this Scientific Journal Video about Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics at JoVE.com

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחל מערכת העצבים ההיקפית הם מודלים שימושי להבהיר הן בכלל נוירון מעמד ספציפי מנגנוני התמיינות נוירון. אנו מציגים מדריך מעשי ליצור ולנתח הדנדריטים נוירון arborization פסיפסים גנטית.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

15.2K Views.  RIKEN Brain Science Institute. Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית של תסיסנית הזחל מערכת העצבים ההיקפית הם מודלים שימושי להבהיר הן בכלל נוירון מעמד ספציפי מנגנוני התמיינות נוירון. אנו מציגים מדריך מעשי ליצור ולנתח הדנדריטים נוירון arborization פסיפסים גנטית.

Video: Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval body wall contains several cell types that are models to study cell and tissue morphogenesis. For example tracheae are used to examine tube morphogenesis1, and the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larva have become a primary system for the elucidation of general and neuron-class-specific mechanisms of dendritic differentiation2-5 and degeneration6.
The shape of dendrite branches can vary significantly between neuron classes, and even among different branches of a single neuron7,8. Genetic studies in DA neurons suggest that differential cytoskeletal organization can underlie morphological differences in dendritic branch shape4,9-11. We provide a robust immunological labeling method to assay in vivo microtubule organization in DA sensory neuron dendrite arbor (Figures 1, 2, Movie 1). This protocol illustrates the dissection and immunostaining of first instar larva, a stage when active sensory neuron dendrite outgrowth and branching organization is occurring 12,13.
In addition to staining sensory neurons, this method achieves robust labeling of microtubule organization in muscles (Movies 2, 3), trachea (Figure 3, Movie 3), and other body wall tissues. It is valuable for investigators wishing to analyze microtubule organization in situ in the body wall when investigating mechanisms that control tissue and cell shape.

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how complex cell shapes, such as neuronal dendrites, are achieved during development, it is important to be able to accurately assay microtubule organization. Here we describe a robust immunohistological labeling method to examine microtubule organization of dendritic arborization neuron sensory dendrites, trachea, muscle, and other Drosophila larva body wall tissues.

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...