עבודה זו נתמכה על ידי ניוון שרירים האגודה, NIH (NS062320).

1. תת עורי מתן muscarinic קולטן האצטילכולין (mAChR) היריבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בתנאים aseptic את המינון המתאים של אנטגוניסט mAChR, (ראה לוח) על ידי המסת התרופה מלח פיזיולוגית סטרילית בצינור התגובה 1.5mL. היריבים הבאים שימשו: אטרופין, Methoctramine, 4 לח, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 50μl של פתרון לתוך מזרק אינסולין a1cc ולהשתמש מזרק נפרד עבור כל עכבר. כמו כן להכין מזרקים המכילים מלח פיזיולוגיים רק עכבר אחד בקבוצת הביקורת. תחזיקי את המזרקים על הקרח עד מוכנים להזריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים עם קוקטייל קטמין-xylazine (120 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין, 8 מ&quot;ג / ק&quot;ג xylazine) בדיקת עומק ההרדמה המתאים ידי התבוננות חוסר התגובה הבוהן קמצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סדציה נאותה, לגלח את השיער שכיסה את האזור מקורי של הראש לאזור הזנב של הצוואר, נגב שאר השיער משם עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום העכבר תחת stereomicroscope, והכנס במקביל מחט לשריר LAL תוך משיכת בקלילות על מחט של מזרק (איור 1 א &#39;, ב). הדבר מבטיח כי המחט מוחדרת לתוך רקמת החיבור המכסה ואינו ישירות הנזק לשריר LAL עצמו. הכנס את המחט כך קצה מכסה את ההיבט הזנב של שריר LAL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מתחילים להזריק פתרון מעל השריר LAL הנכון תוך הוצאת מזרק; הזמן הזרקה הכולל צריך להיות כ 1 דקה. אם מזריקים כראוי, הפתרון צריך להקים &quot;כיפה&quot;, כלומר בערך 1 ס&quot;מ קוטר, בעור שמעל שיישארו לפחות שעה אחת. פתרון מוזרק אחיד יכסה את האזורים מקורי ואת הזנב כולו של השריר LAL הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך כל 12 שעות 1 עד 7 ימים. עבור studies1 אחרים, השתמשנו באותו פרוטוקול להזריק גורמי גדילה כל 12 שעות למשך עד 21 ימים. התגובות לא נורמלי נצפו מעכברים מנוהל עם 2x הרדמה ביום למשך עד 21 ימים. </li></ol> 2. Dissection של השרירים LAL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital (390 מ&quot;ג / ק&quot;ג). המוות הוא מובטח על ידי הערכת חוסר דופק לאחר פתיחת בית החזה מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את העכבר בצלחת לנתיחה, צד הגב עם פין 1 בכף כל פין 1 דרך האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החתך הראשון דרך העור בלבד, בעזרת מספריים קטנים באביב לחתוך לאורך LAL שמאל מאזור הפרוקסימלי רק לאוזן לאזור סביב השכמה השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את העור באזור זה, אך להימנע חיתוך קרוב מדי לאוזן ימין כמו זו אחת הנקודות ההתקשרות עבור השריר LAL הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר רקמת השומן ממוקם במרכז רצועת השומנים לאורך קו האמצע, על פני השטח השטחיים של הראש, שם את השרירים LAL ימין ועל שמאל להיפגש. בעזרת מספריים באביב קטן, לחתוך 1cm בצד ימין של רקמת שומן (לכיוון האוזן השמאלית) מן הקצה הפרוקסימלי של שריר LAL שמאל והגיע עד הכתף (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החתך הוא עשה, לקלף את השריר האחורי LAL ימין עם מלקחיים קטנות כדי לחשוף את הצד הגחוני של השריר. חתוך את רקמת החיבור fascia תוך הקפדה על משיכת שריר LAL ימין עם מלקחיים (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים בסביבות סוף הזנב של LAL את הזכות בבסיס האוזן. המשך חיתוך, נע לקראת סוף מקורי של האוזן הימנית, תוך שמירה על LAL ימין והתהפך (איור 1C).. עדיף לכלול רקמה יותר בשלב זה מאשר הסיכון לפגיעה LAL עצמו. אם השריר מתחיל להתייבש, פיפטה 1X PBS מעל השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום גזור LAL זכות בצלחת 30mm תרבות Sylgard המכיל 1X PBS, בצד הגבי למעלה. הצמד מטה ארבע פינות של שריר עם סיכות חרקים קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים קטנים מספריים האביב, רקמת חיבור נקי ממשטחי הגבי ו הגחון של שריר LAL הנכון. הפעל מחדש את השריר פינים כדי לנקות את השטח הגחון. 2-3 השרירים יוטלו בצלחת 30mm אותו. </li></ol> 3. Immunostaining טריפל של NMJs LAL: יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת immunostaining, להכין את כל ריאגנטים הצורך. 1X PBS, 2% שור BSA אלבומין) / PBS, 0.1M גליצין ב 2% BSA / PBS, טריטון X100 0.2% ב 2% BSA / PBS, ו paraformaldehyde 4% (PFA) ב 1X PBS יהיה צורך. טרום מגניב מתנול במקפיא -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו השרירים LAL הצמיד בצד הגבי צלחת מעלה במהלך תהליך זה. בטל פתרון 1X PBS ולהוסיף מספיק 4% (PFA) כדי לכסות את השריר. מניחים על צלחת שייקר להגדיר במהירות 2 או 3 למשך 20 דקות. אלא אם נאמר אחרת, המנה צריך להיות ממוקם על שייקר את השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PFA 4% ולשטוף את השריר עם 1X PBS 3 פעמים, 10 &#39;כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק האחרון 1X PBS לשטוף ולהוסיף 0.1M גליצין ב 2% BSA / PBS פתרון 30 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל פתרון 0.1M גליציןד להוסיף 1X PBS המכיל מצומדות rhodamine α-bungarotoxin בריכוז של 1:200 עבור 15 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל α-bungarotoxin פתרון ולשטוף שריר 1X PBS, 3 פעמים 10 &#39;כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize באמצעות הוספת רקמה טרום מקורר מתנול במקום צלחת במקפיא ° C ל -20 בדיוק 5 דקות, לא רועד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מתנול לשטוף 3 פעמים 10 &quot;כל אחד עם 1X PBS. בטל לשטוף האחרון רקמות לחסום עם 0.2% Triton X-100 ב 2% BSA / PBS שעה 1. הצעדים כביסה חסימת מבוצעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שרירי הלילה, טלטולים, ב 4 מעלות צלזיוס קוקטייל של נוגדנים העיקרי מדולל הפתרון חוסם (ראה לוח). </li></ol> 4. Immunostaining טריפל של NMJs LAL: יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השרירים 1X PBS 3 פעמים, 10 &quot;כל בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קוקטייל של נוגדנים משני חסימת פתרון 1 שעה בטמפרטורת החדר (ראה לוח). השרירים חייבים להיות מוגנים מפני אור ואילך צעד זה כדי למנוע צילום של הלבנת פלואורסצנציה 647-Alexa פלואוריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השרירים 1X PBS 3 פעמים, 10 &#39;כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את כל רקמת החיבור שנותרו 1X PBS, לחתוך את הגבולות לרוחב של שרירי לאל הר בשקופיות בצד הגב למעלה, באמצעות זכוכית כיסוי מחליק התקשורת גובר. השתמש ברור לק כדי להבטיח כיסוי להחליק במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן שקופיות אור ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לניתוח. </li></ol> 5. הדמיה של Confocal NMJs LAL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות ברזולוציה גבוהה confocal מתקבלים עם מטרה Apo לייקה תכנית שמן 63X (1.4NA) על מיקרוסקופ TCS 4D לייקה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והעמסת ו אלקסה 647 אותות נסרקו בו זמנית עם קווי לייזר 488 ננומטר (ארגון, 488 ננומטר, 20 mW) ו - 633 ננומטר (HeNe, 633 ננומטר, 10 mW), בהתאמה. ברצף, אות Rhodamine נסרק אז עם קו לייזר 561 ננומטר (DPSS, 561, 20 mW). סעיפים אופטי נאספו 0.3 מיקרומטר במרווחים, ומספר תמונות מטוס-z המגוון 60-80. חריר מותאם Airy 1 (107.97 אממ). פורמט תמונה 1024 x 1024 (X, Y), עם מקדם הגדלה של 1, על תוצאות מהירות 400Hz בגודל תמונה של 234.32 x 234.32 מיקרומטר מיקרומטר ו גודל פיקסל של 229.05 x 229.05 ננומטר ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייקה TCS-NT תוכנה רכישת מכן נעשה שימוש כדי לשחזר Z-סדרת תמונות לתוך תחזיות בעוצמה מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות Multipanel מותאמים הבהירות והניגודיות באמצעות Adobe Photoshop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שריר LAL טיפוסי, אחד צריך להיות מסוגל לנתח כ 75-100 NMJs en פנים. יציבות Synaptic נקבעת על ידי תכונות כגון יישור המרחבי של טרום, פרי ו postsynaptic אלמנטים (כלומר, עצב, תאים שוואן שרירים), מדידות של שטח סינפטי (כלומר, גודל סינפסה). </li></ol> נציג התוצאות: בשלב NMJ של יונקים בוגרים, האקסון יחיד מנוע מרחיב סניפים בסדר כי טופס מאוד סוכות הבדיל מסוף העצב (איור 2; הירוק) על סיב שריר בודד, apposed בדיוק אשכולות postsynaptic של AChRs ניקוטינית (איור 2; האדום) . Perisynaptically, מסוף בתאי שוואן בחוזקה לכסות את כל הסניפים של מסופי העצב presynaptic (איור 2; כחול). שלמות מבניים ותפקודיים של הארגון הזה היא משולשת קשות מוטרד היישום היומיומי של תת סוג ספציפי מעכבי mAChR. בדוגמה המוצגת כאן (איור 3), 4 לח, אנטגוניסט mAChR בזיקה גבוהה עבור M1, M3, M4 ו M5 תת mAChR, מעורר חיסול סלקטיבי של מסופי עצב NMJs רבים ברחבי השטח שריר (איור 3B, ג). בנוסף, בתאי שוואן הם מסוף שקט באופן חריג 8 כפי שמעידים תיוג S100 בהיר ללא הארכת תהליך (איור 3B &quot;, 3C&quot;). Postsynaptically, סיבי שריר תקינים ואין אובדן nAChRs (איור 3 ב &#39;, 3C&#39;). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. למיקום ארגון אנטומיים של שריר LAL. מיקום מקורי (rLAL), הזנב (כלל), ואת העצב LAL (LALn) להקות endplate המקביל מוצגות (A, הבלעה). המיקום והכיוון של המחט ביחס לשריר LAL מוצג עבור ההליך הזרקה (B). נקודות החתך מוצגים עבור ההליך דיסקציה (C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. ארגון המשולשת של NMJ. הגדלה גבוהה צפיות confocal של NMJ העכבר. האקסון יחיד מרחיב סניפים מסוף מצוין (A), מכוסה היטב על ידי תא שוואן הטרמינל התהליכים שלהם (א &#39;, כוכביות הצבע גופים מסוף שוואן תאים). Postsynaptically סיב שריר, מקבץ של AChRs ניאציניות הוא apposed בדיוק ענפי עצב terminals מסוף בתאי שוואן. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. LAL השרירים שטופלו 4-ולח, אנטגוניסט mAChR. צפיות confocal נמוכה הגדלה גבוהה של השרירים LAL שטופלו רכב או 4-לחה. בניגוד שריר רכב שטופלו (A-NMJs&#39;&#39;&#39;), רבים 4-לחות שטופלו חוסר שריר מסופי העצב (B-B&#39;&#39;&#39;, C-C&#39;&#39;&#39;). אזור התאגרף באיור 2B הוא zoomed באיור 2C.

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן היתרי חקירה של תפקידים מוכרים בעבר של mAChR-תת ספציפיים איתות ביציבות ותחזוקה של NMJs יונקים. שיטה זו תהיה גם שימושית כדי לבדוק את ההשפעות של גורמים neurotrophic וסוכני תרופתי. לדוגמה, המעבדה שלנו מצאו כי פקטור neurotrophic ריסי (CNTF) שהושרו מבצבצות כמעט כל מסופי LAL העצ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> קטמין </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> מנה: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xylazine </td><td> לויד מעבדות </td><td> LA33806 </td><td> מנה: 8mg/kg </td></tr><tr><td> אטרופין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A0132 </td><td> (&gt; טוהר 98%); מנה: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> אטרופין </td><td> וויגט גלובל הפצה </td><td> AT105 </td><td> התרופות כיתה </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M105 </td><td> מנה: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4 לח </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D142 </td><td> מנה: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1105 </td><td> 250 </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1345 </td><td> 50 - -500 </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> פפטידים הבינלאומי </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0.1M - 1M </td></tr><tr><td> פוספט 1X שנאגרו pH מלוחים, 7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> דיג </td><td> T353-500 </td><td> הפוך את הפתרון של 10% לראשונה על ידי המסת מים 10g/100mL דה מיונן מזוקקים; לעשות 4% עם 1X PBS, כדי להתאים את ה-pH 7.4 </td></tr><tr><td> Pentobarbitol נתרן </td><td> Virbac לבריאות בעלי חיים </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> מנה: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> חלק # 184 </td><td> עקוב אחר ההוראות המצורפות בערכה, ניתן להשתמש תרבות מרובים צלחת בגודל (30 מ&quot;מ, 60 מ&quot;מ, 100 מ&quot;מ), בהתאם לצרכים </td></tr><tr><td> 0.1M גליצין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G-7126 </td><td> הוסף 0.185g כדי 25mL של 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% שור בסרום אלבומין (BSA 2%) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A3059-100 </td><td> ממיסים 2g BSA לתוך 100 מ&quot;ל של 1X PBS </td></tr><tr><td> טריטון X100 0.2% ב 2% BSA / PBS (Buffer חסימה) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T9284-100 מ&quot;ל </td><td> ממיסים 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> שימוש בריכוז של 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger Monoclonals </td><td> SMI312 </td><td> שימוש בריכוז של 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק </td><td> SV2-Supernatant </td><td> שימוש בריכוז של 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> שימוש בריכוז של 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-עיזים אנטי עכבר IgG1 </td><td> רוש </td><td> 03117731001 </td><td> שימוש בריכוז של 1:200, אבל אם הרקע הוא גבוה, לנסות 1:400 </td></tr><tr><td> אלקסה, פלואוריד 647 עיזים מצומדות נגד ארנב </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> שימוש בריכוז של 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield פלורסנט הרכבה התקשורת </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H-1000 </td><td> זה לא קשה להגדיר התקשורת, תצטרך להבטיח את פליטת לכסות עם לק ברור. </td></tr><tr><td> האביב מספריים קטנים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

שרירי הגפיים האחוריות של מכרסמים, כגון הגסטרוקנמיוס ו tibialis הקדמי, משמשים לעתים קרובות במחקרים פרמקולוגיים vivo של אותות חיוני ליצירת ותחזוקה של NMJs יונקים. עם זאת, חדירת התרופה לתוך השרירים הללו לאחר תת עורית או תוך שרירית הממשל היא לעתים קרובות לא שלם או אחיד NMJs רבים יכולים נותרות בעינן. אמנם הממשל מערכתית עם מכשירים כגון מיני משאבות יכולים לשפר את ההשפעות spatiotemporal, אופי פולשני של גישה זו עלולה לגרום תגובות דלקתיות בלבול ו / או נזק לשרירים ישיר. יתר על כן, ניתוח מלא של NMJs בשריר הגפיים האחוריות הוא מאתגר, מכיוון שהיא דורשת זמן רב חתך סדרתי immunostaining נרחב. LAL העכבר הוא סדין דק, שטוח של שריר הממוקם על שטחי dorsum של הצוואר. הוא עווית שריר מהיר שמתפקד להעביר את פינה. הוא מכיל חלקים מקורי ואת הזנב שמקורם קו האמצע של הגולגולת ולהרחיב רוחבית לחלק סחוסי של כל פינה. השריר מסופק על ידי ענף של עצב הפנים כי פרויקטים caudally מיד עם יציאתו foramen stylomastoid. אנו ואחרים מצאו LAL להיות הכנה נוח כי יתרונות לחקירת הן קצרות וארוכות טווח vivo השפעות של תרופות על NMJs והשרירים. ראשית, המיקום שלה שטחית מקלה יישומים מקומיים רבים של תרופות תחת הרדמה קלה. שנית, הרזון שלה (2-3 שכבות של סיבי שריר) היתרי להדמיה וניתוח של כמעט כל NMJs בתוך השריר. שלישית, את קלות לנתח את זה עם שלם העצב שלה יחד עם דפוס של העצבוב שלו מאפשר ניתוח משלים אלקטרו במבחנה 9,5. לאחרונה, ואולי הכי חשוב, נפח להחיל קטן (~ 50μl) בקלות מכסה את פני השטח כולו שרירים, ומספק חשיפה אחידה וממושכת של כל NMJs שלה לתרופה מבטלת את הצורך בגישה מערכתית 1,8.

Watch this Scientific Journal Video about Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice at JoVE.com

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

אנו מתארים נהלים לניהול חוזרות ונשנות של מעכבי איתות muscarinic כדי longus levator auris (LAL) השרירים של עכברים בוגרים צעירים עבור immunostaining הבאות של צמתים neuromuscular שלה (NMJs) ב wholemounts. השריר LAL יש יתרונות ייחודיים עבור חושף<em&gt; In vivo</em&gt; השפעות פרמקולוגיות על NMJs.

תת עורי מינהל היריבים Muscarinic ו Triple-Immunostaining של השריר Levator Longus Auris של עכברים

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

subcutaneous-administration-muscarinic-antagonists-triple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  Arcadia University. אנו מתארים נהלים לניהול חוזרות ונשנות של מעכבי איתות muscarinic כדי longus levator auris (LAL) השרירים של עכברים בוגרים צעירים עבור immunostaining הבאות של צמתים neuromuscular שלה (NMJs) ב wholemounts. השריר LAL יש יתרונות ייחודיים עבור חושף In vivo השפעות פרמקולוגיות על NMJs.

Video: Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and relapse. Various types of behavioral activity are commonly utilized as measures of drug motivation in animals. However, a crucial component of drug abuse relapse in abstinent cocaine users is "drug craving", which is difficult to model in animals, as it often occurs in the absence of overt behaviors. Yet, it is possible that a class of ultrasonic vocalizations (USVs) in rats may be a useful marker for affective responses to drug administration, drug anticipation and even drug craving. Rats vocalize in ultrasonic frequencies that serve as a communicatory function and express subjective emotional states. Several studies have shown that different call frequency ranges are associated with negative and positive emotional states. For instance, high frequency calls ("50-kHz") are associated with positive affect, whereas low frequency calls ("22-kHz") represent a negative emotional state. This article describes a procedure to assess rat USVs associated with daily cocaine self-administration. For this procedure, we utilized standard single-lever operant chambers housed within sound-attenuating boxes for cocaine self-administration sessions and utilized ultrasonic microphones, multi-channel recording hardware and specialized software programs to detect and analyze USVs. USVs measurements reflect emotionality of rats before, during and after drug availability and can be correlated with commonly assessed drug self-administration behavioral data such lever responses, inter-response intervals and locomotor activity. Since USVs can be assessed during intervals prior to drug availability (e.g., anticipatory USVs) and during drug extinction trials, changes in affect associated with drug anticipation and drug abstinence can also be determined. In addition, determining USV changes over the course of short- and long-term drug exposure can provide a more detailed interpretation of drug exposure effects on affective functioning.

Drug self-administration and ultrasonic vocalizations (USV) are used as behavioral assessments in animal research, but rarely in combination. The purpose of this article is to describe the advantages of recording USVs during drug self-administration procedures to assess affective responses to drug experience.

הערכת קולות Ultrasonic במהלך והתרופות עצמית הממשל חולדות

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences. For instance, addiction to nicotine via tobacco smoking is a leading cause of premature death worldwide (World Health Organization) and is likely caused by an alteration of ion channel distribution in the brain1. Chronic nicotine exposure in both rodents and humans results in increased numbers of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in brain tissue1-3. Similarly, alterations in the glutamatergic GluN1 or GluA1 channels have been implicated in triggering sensitization to other addictive drugs such as cocaine, amphetamines and opiates4-6.

Consequently, the ability to map and quantify distribution and expression patterns of specific ion channels is critically important to understanding the mechanisms of addiction. The study of brain region-specific effects of individual drugs was advanced by the advent of techniques such as radioactive ligands. However, the low spatial resolution of radioactive ligand binding prevents the ability to quantify ligand-gated ion channels in specific subtypes of neurons. 

Genetically encoded fluorescent reporters, such as green fluorescent protein (GFP) and its many color variants, have revolutionized the field of biology7.By genetically tagging a fluorescent reporter to an endogenous protein one can visualize proteins in vivo7-10. One advantage of fluorescently tagging proteins with a probe is the elimination of antibody use, which have issues of nonspecificity and accessibility to the target protein. We have used this strategy to fluorescently label nAChRs, which enabled the study of receptor assembly using F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfected cultured cells11.More recently, we have used the knock-in approach to engineer mice with yellow fluorescent protein tagged &alpha;4 nAChR subunits (&alpha;4YFP), enabling precise quantification of the receptor ex vivo at submicrometer resolution in CNS neurons via spectral confocal microscopy12. The targeted fluorescent knock-in mutation is incorporated in the endogenous locus and under control of its native promoter, producing normal levels of expression and regulation of the receptor when compared to untagged receptors in wildtype mice. This knock-in approach can be extended to fluorescently tag other ion channels and offers a powerful approach of visualizing and quantifying receptors in the CNS.

In this paper we describe a methodology to quantify changes in nAChR expression in specific CNS neurons after exposure to chronic nicotine. Our methods include mini-osmotic pump implantation, intracardiac perfusion fixation, imaging and analysis of fluorescently tagged nicotinic receptor subunits from &alpha;4YFP knock-in mice (Fig. 1). We have optimized the fixation technique to minimize autofluorescence from fixed brain tissue.We describe in detail our imaging methodology using a spectral confocal microscope in conjunction with a linear spectral unmixing algorithm to subtract autofluoresent signal in order to accurately obtain &alpha;4YFP fluorescence signal. Finally, we show results of chronic nicotine-induced upregulation of &alpha;4YFP receptors in the medial perforant path of the hippocampus.

We have developed a novel technique of quantifying nicotinic acetylcholine receptor changes within subcellular regions of specific subtypes of CNS neurons to better understand the mechanisms of nicotine addiction by using a combination of approaches including fluorescent protein tagging of the receptor using the knock-in approach and spectral confocal imaging.

דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdialysis של אתנול במהלך אתנול נחישות ממשל עצמי ואתנול אופרנטית על ידי גז כרומטוגרפיה

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

קידום ההישרדות וההתמיינות של תאי גזע עצביים עם פיברין וקוקטיילי גורם גדילה לאחר פגיעה בחוט השדרה חמורה

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

רצפטורים פרופריוספציה והמתח בסרטן איברים: תרגילי מעבדה הסטודנטים

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control neuroplastic processes and correct abnormal function, or even shift functions from damaged tissue to physiologically healthy brain regions, hold the potential to dramatically improve overall health. Of the current neuroplastic interventions in development, neurofeedback training (NFT) from functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) has the advantages of being completely non-invasive, non-pharmacologic, and spatially localized to target brain regions, as well as having no known side effects. Furthermore, NFT techniques, initially developed using fMRI, can often be translated to exercises that can be performed outside of the scanner without the aid of medical professionals or sophisticated medical equipment. In fMRI NFT, the fMRI signal is measured from specific regions of the brain, processed, and presented to the participant in real-time. Through training, self-directed mental processing techniques, that regulate this signal and its underlying neurophysiologic correlates, are developed. FMRI NFT has been used to train volitional control over a wide range of brain regions with implications for several different cognitive, behavioral, and motor systems. Additionally, fMRI NFT has shown promise in a broad range of applications such as the treatment of neurologic disorders and the augmentation of baseline human performance. In this article, we present an fMRI NFT protocol developed at our institution for modulation of both healthy and abnormal brain function, as well as examples of using the method to target both cognitive and auditory regions of the brain.

The ability to induce and/or control neural plasticity may be critical in future treatments for neurologic disorders and the recovery from brain injury. In this paper, we present a protocol on the use of neurofeedback training with functional magnetic resonance imaging to modulate human brain function.

פרוטוקול עבור fMRI ניהול בזמן אמת Neurofeedback אימונים

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Recording Brain Electromagnetic Activity During the Administration of the Gaseous Anesthetic Agents Xenon and Nitrous Oxide in Healthy Volunteers

Anesthesia arguably provides one of the only systematic ways to study the neural correlates of global consciousness/unconsciousness. However to date most neuroimaging or neurophysiological investigations in humans have been confined to the study of &#947;-Amino-Butyric-Acid-(GABA)-receptor-agonist-based anesthetics, while the effects of dissociative N-Methyl-D-Aspartate-(NMDA)-receptor-antagonist-based anesthetics ketamine, nitrous oxide (N2O) and xenon (Xe) are largely unknown. This paper describes the methods underlying the simultaneous recording of magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) from healthy males during inhalation of the gaseous anesthetic agents N2O and Xe. Combining MEG and EEG data enables the assessment of electromagnetic brain activity during anesthesia at high temporal, and moderate spatial, resolution. Here we describe a detailed protocol, refined over multiple recording sessions, that includes subject recruitment, anesthesia equipment setup in the MEG scanner room, data collection and basic data analysis. In this protocol each participant is exposed to varying levels of Xe and N2O in a repeated measures cross-over design. Following relevant baseline recordings participants are exposed to step-wise increasing inspired concentrations of Xe and N2O of 8, 16, 24 and 42%, and 16, 32 and 47% respectively, during which their level of responsiveness is tracked with an auditory continuous performance task (aCPT). Results are presented for a number of recordings to highlight the sensor-level properties of the raw data, the spectral topography, the minimization of head movements, and the unequivocal level dependent effects on the auditory evoked responses. This paradigm describes a general approach to the recording of electromagnetic signals associated with the action of different kinds of gaseous anesthetics, which can be readily adapted to be used with volatile and intravenous anesthetic agents. It is expected that the method outlined can contribute to the understanding of the macro-scale mechanisms of anesthesia by enabling methodological extensions involving source space imaging and functional network analysis.

Simultaneous magnetoencephalography and electroencephalography provides a useful tool to search for common and distinct macro-scale mechanisms of reductions in consciousness induced by different anesthetics. This paper illustrates the empirical methods underlying the recording of such data from healthy humans during N-Methyl-D-Aspartate-(NMDA)-receptor-antagonist-based anesthesia during inhalation of nitrous oxide and xenon.

פעילות אלקטרומגנטית הקלטה של המוח במהלך כהונתו של סוכנים הרדמה גז Xenon ו תחמוצת החנקן מתנדבים בריאים

Anesthesia arguably provides one of the only systematic ways to study the neural correlates of global consciousness/unconsciousness. However to date most ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ex vivo preparation of the levator auris longus (LAL) is used because it is a thin muscle that provides easy visualization of the neuromuscular junction for microelectrode impalement at the motor endplate. This method allows for the recording of spontaneous miniature endplate potentials and currents (mEPPs and mEPCs), nerve-evoked endplate potentials and currents (EPPs and EPCs), as well as the membrane properties of the motor endplate. Results obtained from this method include the quantal content (QC), number of vesicle release sites (n), probability of vesicle release (prel), synaptic facilitation and depression, as well as the muscle membrane time constant (&#964;m) and input resistance. Application of this technique to mouse models of human disease can highlight key pathologies in disease states and help identify novel treatment strategies. By fully voltage-clamping a single synapse, this method provides one of the most detailed analyses of synaptic transmission currently available.

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

The protocol described in this paper uses the mouse levator auris longus (LAL) muscle to record spontaneous and nerve-evoked postsynaptic potentials (current-clamp) and currents (voltage-clamp) at the neuromuscular junction. Use of this technique can provide key insights into mechanisms of synaptic transmission under normal and disease conditions.

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...