This study was supported by the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Project grant 1022839. AJH is an Australian Research Council (ARC) FT3 Future Fellow (FT100100835). The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health acknowledges support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Grant.

הערה: כל הליכי הניסוי על בעלי חיים אושרו על ידי מכון Florey של ועדת בריאות בעלי החיים Neuroscience ונפש אתיקה ולהתאים לבריאות הלאומית של אוסטרליה ומועצה למחקר רפואי שפורסמה קוד של תרגול לטיפול ולשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (7 מהדורה ה, 2004). 1. מניפולציות סביבתיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיוך מגדרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב(&gt; 8 שבוע ישן), גבר באותו גיל בגרות מיני ונקבות עכברים. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל עכברי C57BL / 6, אבל יש לי אותו התוצאות באמצעות עכברים שוויצריים בפרוטוקול זה. אנחנו בדרך כלל להשתמש n = 8 זכרים וn = 8 נקבות לכל ניסוי, מחולק ל= 2 זוגות של גברים וגבריים n (n = 4 זכרים), n = 2 זוגות נקבה-נקבה (n = 4 נשים), וn = 4 זוגות של גברים ונשים (n = 4 זכרים ונקבות n = 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ההגעה למתקן החזקת בעלי חיים, הקבוצה-בית העכברים לפי מגדר ל&gt; 3 ימים להתאקלם. פה וthrougHout הזיווג בין המינים, לשמור על גירויים סביבתיים חיצוניים (טמפרטורת סביבה לדוגמא, אור: מחזור כהה, מזון, מים, טיפול וניקוי) קבועה או להפיץ באופן שווה לכל העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אקראי להקצות לכל עכבר לזוג גברי-גברי, זוג נקבה-נקבה, או זוג של זכר ונקבה. מניחים כל זוג לכלוב נקי בבידוד (2 עכברים / כלוב) גישה כרצונך מודעת מזון ומים עם, ופשוט לשכן אותם בדרך זו ברציפות במשך 7 ימים. הערה: בעלי חיים שגרתיים בסדר בתקופה זו, אך חייב להיות מופץ באופן שווה לכל העכברים. תשמור על עצמך כדי להימנע מזיווג של המלטת זכר ונקבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העשרה סביבתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב(&gt; 8 שבוע ישן) עכברי זכר או נקבה מגיעה לבגרות מינית, באותו גיל. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל n = 18 עכברים לכל ניסוי, מחולקים לקבוצת n = 6 / טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ההגעה למתקן החזקת בעלי החיים לשמור אותם שוכנו בתקן זהה-שוכנו קבוצה (SH) (לדוגמא: </em&gt; ראה בהמשך) תנאים בשלב זה ל&gt; 3 ימים להתאקלם. כאן ובכל רחבי הניסוי, לשמור על גירויים סביבתיים חיצוניים (טמפרטורת סביבה לדוגמא, אור: מחזור כהה, מזון, מים, טיפול וניקוי) קבועה או להפיץ באופן שווה לכל העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל העשרה סביבתית, באופן אקראי להקצות לכל עכבר לאחת מהקבוצות 3: SH; גלגל ריצה (RW), או בסביבה מועשרת (EE) ולמקם את כל קבוצה של עכברים לכלוב נקי זהה גישה כרצונך מודעת מזון ומים עם יחד. הערה: הנה, כלובים גדולים מחזיק חולדה לכל הקבוצות, מדידת 27 סנטימטרים רוחב, 42 סנטימטרים ארוכים, ו -16 סנטימטרים העומק הייתה בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, מספק התנאים הבאים סביבתיים לכל קבוצה: SH הכולל המלטה בלבד (כדורי נייר או נסורת) על הרצפה; גלגלי SH הכולל RW בתוספת 2 ריצה; EE הכולל RW בתוספת צעצועים (חבלים, סולמות, מנהרות, ואובייקטים כגון לחמניות מגבת נייר ריקות וחתיכות של נייר טישו) שבה לשעבר<html> plore, לשחק, לטפס, להסתיר, וקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכן אותם בדרך זו ברציפות במשך 14 ימים. הערה: בעלי חיים שגרתיים בסדר בתקופה זו, אך חייב להיות מופץ באופן שווה לכל העכברים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי נושא EE ל&#39;סופר-העשרה &#39;נוספת (SE) על ידי הצבת אותם יחד לכלוב גדול יותר המכיל צעצועים חדשניים ל1hour, 5days / שבוע / יום (אותה שעה בכל יום). הערה: הנה, אמבטיה פלסטיק 46 סנטימטרים רוחב, 69 סנטימטרים ארוכים, ו -40 סנטימטרים עומק הייתה בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על חידוש על ידי הצגת קבוצה שונה של צעצועים בכל מפגש. צעצועים נקיים שיש מחדש הציגו לעכברים עם מים וסבון ו- 80% אתנול להסיר ריחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות כל פגישת SE, להחזיר את העכברים לכלוב EE. SH ידית והעכברים RW זהה עכברי SE (פרט לSE עצמו) בתקופה זו (למשל להסיר ולהחזיר כל SH ועכבר RW ולכלוב שלה). </li></ol></li></ol></li></ol>התחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. אוסמוטי משאבה ומוח עירוי צינורית שתלים לעירוי תרופות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבות סטרילי האוסמוטי וערכות עירוי מוח, אשר זמינות באופן מסחרי. היום לפני ההשתלה, באמצעות טכניקת aseptic, ראש השתלים ידי מילוי כל משאבה, חיבור צינור וצינורית עם פתרון סמים או כלי רכב סטרילי (כפי שמתואר בהוראות המצורפות למשאבות). לחבר אותם יחד ודגירה בתמיסת מלח סטרילית לילה בשעה 37 ° C. דגירה שתלי סמים ומלא כלי רכב בנפרד, כדי למנוע זיהום צולב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח. הערה: בהתאם למדינה של הנסיין, היתרי ניסויים בבעלי חיים מיוחדים או קצבאות נדרשות להמשיך סוגים כאלה של ניתוח וניסויים שלאחר ניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הציוד כירורגי ולהעסיק טכניקת ספטית לאורך כל דרך. הרדימי עכבר (למשל באמצעות isofluorane 1-2% באוויר) ולמקם אותו בstereheadframe otaxic. בדוק את עומק ההרדמה לאורך כל ההליך ולנהל הרדמה נוספת במידת צורך (למשל העדר נסיגת איבר לקמצוץ כפה רעיל מעיד על הרדמה נאותה). מוגנות להבטיח את העיניים מהתייבשות על ידי משחה עין חומר סיכה, ושטמפרטורת הגוף של העכבר נשארה נורמלית לאורך כל ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו האמצע דרך העור החל מבין העיניים וגימור 2 סנטימטר אחורי עד לקצה האחורי של הגולגולת. בוטה לנתח את העור מfascia הבסיסי במורד הגב של העכבר כדי ליצור &quot;כיס&quot; גדול מספיק כדי להתאים את המשאבה וצינור חיבור פעם הצינורית מושתלת (צינור החיבור לא צריך להיות כפוף עם השלמה) בנוחות תת-עורי. לגרד לנקות את fascia מרחבי היבט הגב של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בר שיניים קוטר כ 1.5 מ&quot;מ, לתחקר מטה לתוך הגולגולת בstereotaxic המתאים מרכז until שכבה דקה וגמישה של עצמות שרידים. פיל שכבה זו משם באמצעות מלקחיים עדינים (זה ימנע נזק למאטר בסיס הדורה ומוח עם בר השיניים). להבטיח את הגולגולת הוא ניקה מכל שברי העצם ודם, וכי אין דימום נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצינורית שנערכה על ידי בעל צינורית, למקם את המשאבה וצינור חיבור ל&#39;הכיס &#39;תת-עורי מעל גבו של העכבר. בשלב הבא, עמדת הקצה של הצינורית בקואורדינטות stereotaxic המתאימות ועל פני השטח של המוח. בזהירות להוריד את הצינורית לתוך המוח אבל להפסיק כ 1 מ&quot;מ קצר של העומק הנדרש. הערה: העומק שנותר יהיה משא ומתן הבא של יישום השכבה הראשונה של אקריליק שיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שוב את פני השטח של הגולגולת הוא נקי ויבש, ואז להכין נפח קטן של אקריליק שיניים ולהשתמש בקיסם כדי להחליק אותו על האזור כולו החשוף של גולגולת, ובכלל זה לבר-החור דרך הגולגולת סביב הצינורית דואר. לפני אקריליק מתקשה, להוריד את הצינורית להטות את העומק שנותר ליעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עוד נפח קטן של אקריליק שיניים ושכבה זו מעל הראשון, כמו גם על תמיכת הפלסטיק הלבנה לצינורית, כדי לתקן את הצינורית במקום. חזור עם שכבות נוספות של אקריליק על פי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע אקריליק יש קשוח, להסיר בזהירות את בעל צינורית ומנותק הכרטיסייה הלבנה הפלסטיק נשלפת צינורית באמצעות סכין אזמל מחומם עם להבה בוטאן. לבסוף, תפר את העור נסגר מעל כל השתל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול לאחר ניתוח של בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה אנטיספטית לשוליים העור, ולנהל אנטי דלקתי לעכבר (למשל Meloxicam, 3 מ&quot;ג / קילוגרם sc). הסר את העכבר מהמסגרת, למקם אותו מתחת לפנס חום, ולהתבונן עד שהוא חוזר להכרה. אל תחזור עכבר שעבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין. הערה: Expיכולות להיות יזם מניפולציות erimental כגון זיווג בין המינים והעשרת סביבה או חידשו היום לאחר ניתוח בבית המוקדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על משקל גופם, התנהגות כללית ומראה יומיומי. פנק את סימני הזיהום (למשל נפיחות, אדמומיות, מוגלה) סביב חתכים ניתוחיים במשחה אנטיספטית אקטואלית. לטפל בכל מחלה סימנים, כאב, מתח או אי נוחות (למשל אובדן&gt; 10% ממשקל גוף, הנסיגה חברתית, חוסר הטיפוח, &quot;מתפיח&quot;, תפקוד לקוי של תנועה, פרכוסים) עם משככי כאבים ו / או אנטיביוטיקה מערכתיים בהתאם לצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים אם&gt; 15% ירידה במשקל או תסמינים של מחלה, כאב, מתח או אי נוחות הן לא-ההשבה בתוך השבוע של טיפול מתקנת 1. </li></ol></li></ol> רקמות הכנת 3. מוח, אימונוהיסטוכימיים עיבוד, וstereology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר מניפולציות / סמים סביבתיים, להכין את המוח למחקר. <br/&gt; הערה: בניסויים שדווחו כאן מספר TH SNC + נוירונים נמדד והושווה בכל אחת מקבוצות הטיפול השונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית לנהל מנת יתר של חומר הרדמה כדי להרוג את העכברים (למשל 100 מ&quot;ג / קילוגרם ip נתרן pentobarbitone). ברגע שהרדים אבל לפני הלב מפסיק לפעום, להניח את העכבר על גבה ולקשור או להצמיד את שני forelimbs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל לחתוך את העור שמעל בית החזה ואז לחתוך דרך השריר, ממש מתחת לכלוב הצלעות לתוך חלל הבטן. הנח מהדק על תהליך xiphoid של בית החזה ולהרים את החזה למעלה מן הכבד חושף את הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך דרך הסרעפת ודרך הצלעות רוחבית בשני הצדדים באמצעות מספריים גדולים עד בית החזה יכול להיות מקופל לאחור על הראש כדי לחשוף את הריאות ולב. בעזרת מספריים בסדר לעשות חתך קטן בעלייה הימנית כנקודת יציאה לדם ופתרונות perfused, ואז לחתוך דרך הבסיס של ventri השמאלCLE ולמקם את צינורית דרך החדר השמאלי, אטריום השמאל, ולתוך אב העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הצינורית במקום ולאחר מכן לשאוב (37 ° C) החם heparinized ו -0.1 מלוח M פוספט שנאגרו פיסיולוגי (PBS) דרך כלי הדם עד פתרון יציאת העלייה הימנית הוא חופשי לחלוטין של דם. בשלב הבא, לשאוב (4 ° C) פתרון מקבע קר (paraformaldehyde כגון 4% בPBS) דרך כלי הדם, עד שכל העכבר הוא קבוע גם. הסר את המוח ואת המקום בPBS עם סוכרוז 30% במשך 2-3 ימים עד כיורים המוח. הערה: סוגים אחרים של הכנת רקמה עשויים להיות מיושמים בהתאם למומחיות במעבדה המקבילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת cryosections צפה חינם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך קטעי סדרתי דרך אזורי המוח של עניין ולאסוף אלה בPBS. הערה: אנחנו חותכים 40 מיקרומטר חלקים עבים באמצעות cryostat. סוגים אחרים של חתך ברקמה עשויים להיות מיושמים בהתאם למומחיות בcorrespondiהמעבדה ng. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית לחלבונים של עניין. דגירה סעיפים 5% בסרום נורמלי עז ושל 0.3% X-100 טריטון בPBS בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן immunoreact עם אנטי-TH ארנב polyclonal (1: 400) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, אנטי biotinylated אז polyclonal עז -rabbit (1: 1000) בטמפרטורת חדר למשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, דגירה בavidin-peroxidase (1: 500) בטמפרטורת חדר למשך 1 שעות, ולאחר מכן בcobalt- וdiamino-benzidine-התעצם ניקל (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) בטמפרטורת חדר למשך 18-20 דקות; ל3-5 דקות האחרונות של הדגירה diamino-benzidine להוסיף מי חמצן (0.01%) כדי לזרז ממטרים כרומגן. לשטוף חלקים שלוש פעמים לכל 10min בPBS לפני, אחרי, ובין כל אחד מהשלבים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הסעיפים בשקופיות מיקרוסקופ gelatinized, אוויר היבש אותם, אז כתם Nissl (אדום ניטראלי), ליבש באלכוהול, (X-3B) ברור, וcoverslip. </li></ol></li><li&gt; stereology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את המספר הכולל של TH + וTH- SNC (וVTA וLC) נוירונים בשיטות stereological משוחדות. ודא שstereologist עיוור לטיפול שקיבל. תכלול גליה על בסיס קוטר סומה &lt;מיקרומטר 5 ולספור רק את תאים עם גרעין גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את SNC (וVTA וLC) על ידי המקומות המרחבי של תאי TH + וציוני דרך / גבולות אנטומיים לפי אטלס המוח של Paxinos ווטסון 7. רוזן TH + תאים בתוך מסגרת ספירה (55 x 55 מיקרומטר = 3025 מיקרומטר 2) במרווחי זמן קבוע מראש רגילים (x = 140 מיקרומטר, y = 140 מיקרומטר לSNC; x = 100 מיקרומטר, y = 100 מיקרומטר לVTA וLC) לאורך כל גרעין בכל חלק רביעי. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Aumann, T., Horne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+the+dopamine+phenotype+in+substantia+nigra+neurons.">Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons.</a> Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).</li><li>Sauer, H., Oertel, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+nigrostriatal+dopamine+neurons+following+intrastriatal+terminal+lesions+with+6-hydroxydopamine:+a+combined+retrograde+tracing+and+immunocytochemical+study+in+the+rat.">Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat.</a> Neuroscience. 59, 401-415 (1994).</li><li>Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timecourse+of+striatal+re-innervation+following+lesions+of+dopaminergic+SNpc+neurons+of+the+rat.">Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat.</a> The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).</li><li>Aumann, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+expression+of+tyrosine+hydroxylase+in+adult+mouse+substantia+nigra+pars+compacta+neurons.">Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons.</a> Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).</li><li>Aumann, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SK+channel+function+regulates+the+dopamine+phenotype+of+neurons+in+the+substantia+nigra+pars+compacta.">SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta.</a> Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).</li><li>Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+behavioral+modulation+of+the+number+of+substantia+nigra+dopamine+neurons+in+adult+mice.">Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice.</a> Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Schultz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+dopamine+signals.">Behavioral dopamine signals.</a> Trends in neurosciences. 30, 203-210 (2007).</li><li>Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+bonds+in+male+prairie+vole:+long-term+effects+on+emotional+and+social+behavior,+physiology,+and+neurochemistry.">Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry.</a> Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).</li><li>Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+progenitor+cell+proliferation+and+astrogenesis+in+the+partial+progressive+6-hydroxydopamine+model+of+Parkinson's+disease.">Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).</li><li>Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+new+dopaminergic+neurons+in+the+adult+mammalian+substantia+nigra.">No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).</li><li>Lie, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+substantia+nigra+contains+progenitor+cells+with+neurogenic+potential.">The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).</li><li>Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+proliferation+in+the+adult+hippocampus+and+substantia+nigra+induced+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor.">Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).</li><li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibility+for+neurogenesis+in+substantia+nigra+of+parkinsonian+brain.">Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain.</a> Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).</li><li>Shan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+de+novo+neurogenesis+and+dopaminergic+neurogenesis+in+the+substantia+nigra+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced+Parkinson's+disease-like+mice.">Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice.</a> Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neurogenesis+in+the+adult+mammalian+substantia+nigra.">Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).</li><li>Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transneuronal+regulation+of+tyrosine+hydroxylase+expression+in+olfactory+bulb+of+mouse+and+rat.">Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).</li><li>Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-synaptic+increase+in+RNA+coding+for+tyrosine+hydroxylase+in+a+rat+sympathetic+ganglion.">Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion.</a> Brain research. 339, 151-153 (1985).</li><li>Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preganglionic+nerve+stimulation+increases+the+amount+of+tyrosine+hydroxylase+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion.</a> Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).</li><li>Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preganglionic+nerve+stimulation+increases+mRNA+levels+for+tyrosine+hydroxylase+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion.</a> Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).</li><li>Richard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tyrosine+hydroxylase+gene+expression+in+rat+brain+and+adrenals+by+exposure+to+cold.">Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold.</a> Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).</li><li>Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+increase+in+enzyme+and+peptide+mRNA+in+sympathetic+ganglia+after+electrical+stimulation+in+humans.">Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).</li><li>Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+tyrosine+hydroxylase+mRNA+levels+in+A1,+A2+and+locus+ceruleus+neurons+following+electrical+stimulation+of+A1+noradrenergic+neurons.">Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons.</a> Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).</li><li>Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+mapping+of+direct+inputs+to+midbrain+dopamine+neurons.">Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 74, 858-873 (2012).</li><li>Tepper, J. M., Lee, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+control+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).</li><li>Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+and+brain+repair:+harnessing+the+therapeutic+effects+of+cognitive+stimulation+and+physical+activity+to+enhance+experience-dependent+plasticity.">Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).</li><li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+environments,+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system.">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li><li>Chmiel, D. J., Noonan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preference+of+laboratory+rats+for+potentially+enriching+stimulus+objects.">Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects.</a> Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).</li><li>Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+runway+paradigm+to+assess+the+relative+strength+of+rats'+motivations+for+enrichment+objects.">Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects.</a> Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).</li><li>Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions+and+construct+validity+in+preclinical+models+of+psychiatric+disorders.">Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders.</a> Progress in neuro-psychopharmacology &amp; biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).</li><li>Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+of+preference+for+nesting+material+as+environmental+enrichment+for+laboratory+mice.">Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice.</a> Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).</li><li>Rampon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+on+gene+expression+in+the+brain.">Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).</li><li>Eckert, M. J., Abraham, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+exposure+on+synaptic+transmission+and+plasticity+in+the+hippocampus.">Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).</li><li>Sztainberg, Y., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmental+enrichment+model+for+mice.">An environmental enrichment model for mice.</a> Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).</li><li>Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+brain+plasticity:+towards+an+endogenous+pharmacotherapy.">Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy.</a> Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מניפולציות סביבתיות המוטיבציה מאחורי העיצוב של מניפולציות אלה סביבתיים (זיווג בין המינים והעשרה סביבתית) הייתה לקבוע האם הסביבה, ו / או התנהגות תתבקש על ידי הסביבה, קשורה לשינויים במספר תאי עצב DA המוח התיכון. הדגש היה אפוא במ...

הוא חשב DArgic איתות על ידי תאי עצב באזור הגחון tegmental (VTA) וcompacta סעיפי nigra substantia (SNC) של המוח התיכון להיות חשוב להתנהגויות קוגניטיביות, רגשיות ומוטורי מוטיבציה גמול. עם זאת, איתות DA המוח התיכון יותר מדי או מעט מדי גורמת לתסמינים רבים השבתה במגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות (למשל מחלת פרקינסון, קשב וריכוז והפרעת היפראקטיביות, סכיזופרניה, והתמכרות לסמים). תרופות שתגדלנה או יקטינו DA האיתות להקל על תסמינים אלה, אולם הם גם מייצרים תופעות לוואי מיוחסות לאיתות dysregulated והשפעות חוץ-היעד. יעילות תרופה גם יורדת לאורך זמן בשל תגובות מפצות של המוח. האתגר לכן הוא להחזיר איתות DA המוח התיכון נורמלית באופן יותר ממוקד ופיזיולוגי, וגישה מועדפת היא על ידי הגדלת או הפחתת מספר תאי עצב DA המוח התיכון. ראיות הולכות ומצטברות במשך sevהעשורים eral שהביטוי של גנים וחלבונים מעורבים בחילוף חומרים וDA סחר וקטכולאמינים אחרים בתאים בוגרים הוא לשינוי (שנסקרו ב1). במוח תיכון, מספר immunopositive hydroxylase טירוזין (TH +, אנזים שער הגבלה בסינתזת DA) נוירונים ירידות לאחר מכן מגדילה הבא ממשל עצבי 2,3, בעוד שמספר TH immunonegative (TH-) נוירונים מציג את הדפוס ההפוך (כלומר עליות לאחר מכן יורד 3). זה עולה בקנה אחד עם אובדן ולאחר מכן לקבל של &#39;פנוטיפ DA &quot;על ידי חלק מתאים. מספר הנוירונים TH + וTH- SNC גם הוכח לשנות כיוונים שווים אך הפוכים לאחר טיפולים שונים המשנים את הפעילות החשמלית של תאים אלה 4,5. לדוגמא, עירוי של הקטנות-המוליכות, אשלגן מופעל סידן (SK) apamin אנטגוניסט ערוץ למוח תיכון 2 שבועות מקטין את מספר TH + ועליות (באותו הסכום) נוmber של TH- SNC נוירונים 4,5. בניגוד לכך, עירוי של SK אגוניסט ערוץ 1-EBIO מגדיל את מספר TH + ויורד (באותו הסכום) מספר הנוירונים TH- SNC 4,5. שינויים דומים נראו הבא מגוון טיפולי מיקוד פעילות עצבית SNC, כוללים כמה שממוקדים תשומות מביא 4. תקנה זו לכאורה של מספר הנוירונים SNC DArgic על ידי פעילות עצבית וקלט מביא מעלה את האפשרות שהסביבה או ההתנהגות יכולה להשפיע על מספר הנוירונים SNC. יש אכן עכברים בוגרים שנחשפו לסביבות שונות TH פחות או יותר המוח התיכון (SNC וVTA) + נוירונים, ולפחות חלק משינויים הנגרם סביבה אלה בוטלו על ידי מצור מקביל של קלט הסינפטי במוח תיכון 6. המטרות של תקשורת זו הן: (1) לספק פרטים נוספים על כיצד ליישם המניפולציות הסביבתיות שלנו וחליטות בסמים; ו- (2) ולמסור נתונים נוספים התומכים לטענה שלנו שהדוארnvironment מסדיר את מספר תאי עצב DA המוח התיכון, באמצעות קלט מביא.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Osmotic pump 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Brain infusion kit 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>ALZET cannula holder 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Curing (dental acrylic powder)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM (Meloxicam)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pentobarbitone</td><td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>chemicon-temecula, CA</td><td>S26-Litre</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore Headquarters&amp;nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase</td><td>Merck Millipore Headquarters&amp;nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Avidin peroxidase</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diamino-benzidine</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

environmental modulations of the number of midbrain dopamine neurons in adult mice

שינויים ארוכי טווח במוח או &#39;הגמישות מוחית&#39; עומדים בבסיס התנהגות מסתגלת ותיקון המוח הבא מחלה או פציעה. יתר על כן, יחסי גומלין עם הסביבה שלנו יכולים לגרום לגמישות מוחית. יותר ויותר, מחקר מנסה לזהות אילו סביבות לעורר גמישות מוחית מועילה לטיפול במוח והפרעות התנהגות. שתי מניפולציות סביבתיות מתוארות בי להגדיל או להקטין את מספר immunopositive hydroxylase טירוזין (TH +, אנזים שער הגבלה בדופמין סינתזה (DA)) תאי עצב במוח התיכון העכבר הבוגר. הראשון כולל גברים זיווג ונקבות עכברים יחד ברציפות במשך השבוע 1, אשר מגדיל TH + נוירונים המוח התיכון בכ -12% בגברים, אך יורד TH + נוירונים המוח התיכון בכ -12% בנשים. השנייה כוללת עכברי דיור ברציפות במשך 2 שבועות ב&#39;סביבות מועשרים &quot;(EE) המכילות גלגלי ריצה, צעצועים, חבלים, חומר קינון, וכו &#39;, שבו אניncreases TH + נוירונים המוח התיכון בכ -14% בגברים. בנוסף, פרוטוקול מתואר במקביל יציקת תרופות ישירות לתוך המוח התיכון במניפולציות הסביבתיות אלה כדי לסייע בזיהוי מנגנוני פלסטיות מוח לסביבה מושרה. לדוגמא, EE-גיוס של יותר TH + נוירונים המוח התיכון הוא בוטל על ידי מצור מקביל של קלט סינפטי על נוירונים המוח התיכון. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שמידע על הסביבה מועבר באמצעות קלט סינפטי לנוירונים המוח התיכון כדי לעבור או לבטל ביטוי של גני &#39;DA&#39;. כך, גירוי סביבתי מתאים, או תרופת מיקוד של המנגנונים העומדים בבסיס, עשויה להיות מועילה לטיפול בהפרעות במוח והתנהגות הקשורים לחוסר איזון בDA המוח התיכון (למשל מחלת פרקינסון, קשב וריכוז והפרעת היפראקטיביות, סכיזופרניה, והתמכרות לסמים).

עכברים בוגרים נתון למניפולציות הסביבתיות אלה שינו מספרים של המוח התיכון (SNC וVTA), אבל לא LC, TH + נוירונים, וEE בתוספת עירוי המוח התיכון במקביל של שני picrotoxin או bicuculline (GABA יריבים הקולטן) מבטל EE-גיוס של יותר SNC TH + נוירונים. נתונים אלו פורסמו בעבר ב- 6. הנתונים הנוכחיים לוקט?...

Watch this Scientific Journal Video about Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice at JoVE.com

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

אפנון סביבתי של מספר המוח התיכון דופמין נוירונים בעכברים בוגרים

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

environmental-modulations-number-midbrain-dopamine-neurons-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Views.  The University of Melbourne. This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Video: Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Biology

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

מודל עכבר לייזר המושרה של לחץ תוך עיני מוגבר כרוני לאפיון פגמים חזותיים

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Medicine

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

מודלים לאינטראקציה בין סביבת גנים כדי לחשוף מנגנוני רגישות במחלת פרקינסון

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

שיטות לאפנון וניתוח של Neurogenesis מבוגרים NF-κB תלוי

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

הערכה של דופאמין הומאוסטזיס בעכברים באמצעות ניתוח ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית, דופמין Synaptosomal ספיגת

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

הערכה stereological של דופאמין נוירון במספר העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד אופטי Fractionator

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

פרדיגמת לחץ חברתי בגיל ההתבגרות בעכברי C57BL/6 למחקר התנהגותי

Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL&#47;6 Male and Female Mice

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female rodents is needed to understand its effects on ongoing brain development and behavioral outcomes. The chronic social defeat stress paradigm (CSDS) has been widely used to model social stress in adult C57BL/6 male mice by leveraging on the aggressive behavior displayed by an adult male rodent to an intruder invading its territory. An advantage of this paradigm is that it allows to categorize defeated mice into resilient and susceptible groups based on their individual differences in social behavior 24 h after the last defeat session. Implementing this model in adolescent C57BL/6 mice has been challenging because adult or adolescent mice do not typically attack early adolescent male or female mice and because adolescence is a short period of life, encompassing discreet temporal windows of vulnerability. This limitation was overcome by adapting an accelerated version of the CSDS to be used for adolescent male and female mice. This 4-day stress paradigm with 2 physical attack sessions per day uses a C57BL/6 male adult to prime the CD-1 mouse for aggressiveness such that it readily attacks the male or female adolescent mouse. This model was termed accelerated social defeat stress (AcSD) for adolescent mice. Adolescent exposure to AcSD induces social avoidance 24 h later in both males and females, but only in a subset of defeated mice. This vulnerability occurs despite the number of attacks being consistent across sessions between resilient and susceptible groups. The AcSD model is short enough to allow exposure during discrete periods within adolescence, allows the segregation of mice according to the presence or absence of social avoidance behavior, and is the first model available to study social defeat stress in adolescent C57BL/6 female mice.

מחבר זרקור: הבנת השפעות מצוקה חברתית בגיל ההתבגרות על התפתחות עצבית בעכברים

We developed an accelerated social defeat stress model for adolescent C57BL/6 mice, which works in both males and females and allows exposure during discrete adolescent periods. Exposure to this model induces social avoidance, but only in a subset of defeated male and female mice.

מודל לחץ תבוסה חברתית עבור עכברים מתבגרים C57BL/6 זכרים ונקבות

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female ...